DOI: https://doi.org/ 10.24412/2076-4812-2026-8383-92-96

Внимание! Статья адресована врачам-специалистам

Reymnazarova G.D.

Tashkent State Medical University, Uzbekistan

Diagnostic value of immunohistochemical markers in combination with nanotopographic analysis in precancerous processes of the cervix in the premenopausal period

Резюме. Иммуногистохимическое исследование (ИГХ) и атомно-силовая микроскопия (АСМ) открывают принципиально новые возможности для объективной диагностики предраковых заболеваний шейки матки в предменопаузальном периоде – наиболее сложной для скрининга возрастной группе.

Цель. Оценить диагностическую ценность маркеров p16INK4a, Ki-67 и p53 и их комбинаций с нанотопографическими параметрами АСМ для выявления CIN у женщин 40–65 лет.

Материалы. 402 пациентки в предменопаузе разделены на группу I (n=289, доброкачественные) и группу II (n=113, CIN I–III). Выполнены ИГХ-анализ (p16, Ki-67, p53), АСМ (высота рельефа, размер клеток) и стандартная морфометрия. Применены ROC-анализ, корреляция Спирмена, критерий Манна – Уитни.

Результаты. Диффузная p16 выявлена у 65,4% в группе II (против 21,5% в группе I, p<0,001). Индекс Ki-67 вырос с 8,3±4,2% до 34,7±15,8%. Высота рельефа АСМ снизилась с 1,13±0,28 до 0,74±0,27 мкм. Высота рельефа АСМ обратно коррелировала с p16-экспрессией (r=-0,82, p<0,001). Интегрированный алгоритм из 6 параметров обеспечил AUC 0,97, чувствительность 97,3%, специ-фичность 95,1%.

Заключение. Комбинированный подход ИГХ + АСМ демонстрирует высокую диагностическую точность для CIN II+ и превосходит традиционный цитологический скрининг в предменопаузальной популяции.

Ключевые слова: p16INK4a, Ki-67, p53, атомно-силовая микроскопия, цервикальная интраэпителиальная неоплазия, предменопауза, иммуногистохимия, нанотопография, ROC-анализ, диагностический алгоритм.

Для цитирования: Реймназарова Г.Д. Диагностическая значимость иммуногистохимических маркеров в сочетании с нанотопографическим анализом при предраковых процессах шейки матки в предменопаузальный период // Медицинские новости. – 2026. – №8. – С. 92–96.

Summary.Immunohistochemistry (IHC) and atomic force microscopy (AFM) offer fundamentally new opportunities for the objective diagnosis of precancerous cervical lesions in premenopausal women, the age group in which conventional screening is most challenging.

Objective. To evaluate the diagnostic value of the biomarkers p16IINK4a, Ki-67, and p53, as well as their combinations with AFM-derived nanotopographic parameters, for the detection of cervical intraepithelial neoplasia (CIN) in women aged 40–65 years.

Materials. A total of 402 premenopausal women were enrolled and divided into Group I (n=289, benign cervical conditions) and Group II (n=113, histologically confirmed CIN grades I–III). All participants underwent immunohistochemical analysis of p16, Ki-67, and p53 expression, AFM assessment (surface relief height and cell size), and standard morphometric evaluation. Statistical analyses included receiver operating characteristic (ROC) analysis, Spearman’s correlation, and the Mann – Whitney U-test.

Results. Diffuse p16 expression was detected in 65.4% of patients in Group II compared with 21.5% in Group I (p<0.001). The Ki-67 labeling index increased from 8.3±4.2% to 34.7±15.8%. AFM demonstrated a reduction in surface relief height from 1.13±0.28 to 0.74±0.27 μm. AFM surface relief height showed a strong inverse correlation with p16 expression (r=-0.82, p<0.001). An integrated diagnostic algorithm based on six parameters achieved an area under the ROC curve (AUC) of 0.97, with a sensitivity of 97.3% and a specificity of 95.1%.

Conclusions. The combined IHC-AFM approach demonstrates excellent diagnostic accuracy for the detection of CIN II+ and outperforms conventional cytological screening in premenopausal women.

Keywords: p16INK4a, Ki-67, p53, atomic force microscopy, cervical intraepithelial neoplasia, premenopause, immunohistochemistry, nanotopography, ROC analysis, diagnostic algorithm.

For citation: Reymnazarova G.D. Diagnostic value of immunohistochemical markers in combination with nanotopographic analysis in precancerous processes of the cervix in the premenopausal period // Meditsinskie novosti. – 2026. – N8. – P. 92–96.

___________________________________________________________________________________

Использованные сокращения: CIN – цервикальная интраэпителиальная неоплазия, АСМ – атомно-силовая микроскопия, ВПЧ – вирус папилломы человека, ИГХ – иммуногистохимическое исследование

__________________________________________________________________________________

Цервикальная интраэпителиальная неоплазия (CIN) является непосредственным предшественником инвазивного рака шейки матки и требует своевременного выявления для проведения органосохраняющего лечения [1]. Согласно данным GLOBOCAN (2020), ежегодно в мире регистрируется свыше 600 000 новых случаев рака шейки матки [2]. В Узбекистане за 11 лет заболеваемость выросла на 71%, что диктует необходимость совершенствования диагностических алгоритмов [3].

Предменопаузальный период (40–55 лет) создает значимые затруднения для скрининга. Атрофические изменения многослойного плоского эпителия, обусловленные дефицитом эстрогенов, смещение зоны трансформации в эндоцервикс, изменения pH влагалищной среды – все это суммарно снижает чувствительность цитологии по Папаниколау до 55–70% в данной возрастной группе [4, 5]. ВПЧ-тестирование, хотя и обладает более высокой чувствительностью (>90%), имеет низкую специфичность в предменопаузе из-за высокой частоты транзиторных инфекций [5, 6].

Иммуногистохимические маркеры предоставляют объективную информацию о молекулярных событиях неопластической трансформации. p16INK4a является суррогатным маркером интеграции ВПЧ высокого риска в геном клетки-хозяина и гиперэкспрессии белка Е7, блокирующего Rb-путь [7]. Ki-67 отражает фракцию пролиферирующих клеток и широко применяется в составе двойного окрашивания CINtec® Plus для триажа при аномальной цитологии [8]. p53 в норме выполняет функцию онкосупрессора; его аномальная экспрессия при CIN свидетельствует о нарушении баланса апоптоза и пролиферации [9].

Атомно-силовая микроскопия (АСМ) – сравнительно новый инструмент в онкоморфологии. Метод позволяет получать трехмерные нанотопографические карты поверхности клеток с субнанометровым разрешением и одновременно измерять биомеханические свойства: упругость (модуль Юнга), адгезию, шероховатость [10, 11]. Немногочисленные пилотные работы демонстрируют потенциал АСМ для дифференциации нормальных и диспластических клеток, однако крупных сравнительных исследований в предменопаузальной популяции не проводилось [12].

Настоящее исследование направлено на: (1) характеристику профилей экспрессии p16, Ki-67 и p53 по степеням CIN; (2) оценку нанотопографических параметров АСМ и их корреляции с ИГХ-маркерами; (3) разработку многопараметрического диагностического алгоритма с максимальной точностью для предменопаузальной популяции.

Материалы и методы

Проведено проспективное когортное исследование 402 женщин в предменопаузе (40–65 лет), наблюдавшихся в клинике Ташкентского государственного медицинского университета в 2019–2025 гг. Группа I (n=289): доброкачественные заболевания шейки матки (псевдоэрозии, полипы, эндоцервикоз, плоскоклеточная метаплазия, лейкоплакия). Группа II (n=113, 28,1%): гистологически верифицированный CIN – CIN I/LSIL (n=48, 42,5%), CIN II/HSIL (n=35, 31,0%), CIN III/HSIL (n=30, 26,5%). Средний возраст в группе I – 51,4±7,8 года, в группе II – 49,6±8,2 года. Наличие ВПЧ 16/18 подтверждено у 89,4% пациенток в группе II. Протокол одобрен Этическим комитетом Ташкентского государственного медицинского университета (№12/2019). Все пациентки подписали информированное согласие.

Биопсийный материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (24 ч), заливали в парафин. Серийные срезы толщиной 4 мкм помещали на адгезивные стекла SuperFrost® Plus, депарафинировали, проводили тепловую демаскировку антигенов в цитратном буфере (pH 6,0, 95 °C, 20 мин). Применяли следующие первичные антитела: p16INK4a (клон E6H4, CINtec® Roche, 1:100), Ki-67 (клон MIB-1, Dako, 1:100), p53 (клон DO-7, Dako, 1:100). Вторичные антитела и субстрат DAB (EnVision, Dako). Докрашивание гематоксилином. Оценка результатов: для p16 – паттерны негативный, очаговый (<25% клеток), диффузный (≥25%), интенсивно-диффузный; для Ki-67 и p53 – процент меченых клеток в 500 клетках (hot spot), среднее из 5 полей.

Нативные свежезамороженные образцы (-80 °C) размораживали непосредственно перед исследованием, промывали PBS, наносили на покровные стекла с поли-L-лизиновым покрытием. АСМ выполняли на NanoScope MultiMode 8 (Bruker, США) в режиме PeakForce Tapping в воздушной среде. Зонды ScanAsyst-Air (SiN, k=0,4 Н/м, R≤10 нм). Размер сканирования – 5×5 мкм, разрешение – 512×512 пкс, частота – 0,977 Гц. Для каждого образца записывали не менее 5 сканов в разных участках. Измеряли среднюю высоту рельефа Ra (мкм), размер клеток (мкм), шероховатость Rq. Обработка результатов в NanoScope Analysis 1.9 и Gwyddion 2.62.

Гистологические препараты (Г-Э) анализировали на системе Leica Aperio AT2 (×200–×400) с программой ImageJ 1.53. Измеряли толщину эпителиального пласта (мкм), диаметр и площадь ядра (мкм²), ЯЦО, плотность клеток (кл./мм²). Все измерения выполнены двумя независимыми морфологами в слепом режиме; коэффициент внутриклассовой корреляции (ICC) составил 0,91–0,96.

Непрерывные переменные представлены как M±SD; сравнение – критерий Манна – Уитни (U-тест); категориальные – критерий c². Корреляционный анализ – ρ Спирмена. Диагностическая точность оценивалась методом ROC с вычислением AUC, 95% ДИ, оптимального порога (индекс Youden), чувствительности, специфичности, ПЦП, ПЦО. Сравнение AUC методом DeLong. Многофакторный анализ – логистическая регрессия с корректировкой на возраст и ВПЧ-статус, p<0,05 считали значимым. Расчеты в SPSS v.28 и R 4.3 (пакеты pROC, ggplot2).

Результаты

Профиль экспрессии p16INK4a кардинально различался между группами (c²=89,3, df=2, p<0,001). В группе I преобладали отрицательный (35,7%) и очаговый (42,8%) паттерны; диффузная реакция составила лишь 21,5%. В группе II диффузная экспрессия выявлена у 65,4% пациенток; негативная реакция – лишь у 5,2% (рис. 1).

При анализе по подгруппам CIN прослеживается четкий градиент: диффузная p16 составила 52,1% при CIN I, 74,3% – при CIN II и 90,0% – при CIN III. Интенсивно-диффузная реакция при CIN III регистрировалась в 21,2% случаев против 0% в группе I. Полученные данные свидетельствуют о том, что интеграция ВПЧ высокого онкогенного риска и нарушение Rb-пути происходят уже на стадии CIN I и нарастают в ряду CIN I → CIN III.

Индекс Ki-67 закономерно возрастал при прогрессировании CIN (рис. 2). Средний показатель составил 8,3±4,2% в группе I и 34,7±15,8% в группе II (p<0,001). В подгруппах CIN I – 21,4±8,6%, CIN II – 38,2±10,3%, CIN III – 52,6±12,1%. Доля пациенток с Ki-67 >20% (оптимальный порог по ROC) составила 2,9% в группе I против 57,5% в группе II, у 80% пациенток с CIN III Ki-67 превышал 20% (рис. 2).

Таблица 1. Иммуногистохимические и АСМ-параметры по группам исследования (M±SD или %)

Отношение шансов (OR) для Ki-67 >20% составило 38,4 (95% ДИ 18,7–78,9, p<0,001) после корректировки на возраст и ВПЧ-статус. Чувствительность порога >20% – 78,0%, специфичность – 85,0%, AUC – 0,87 (95% ДИ 0,82–0,92). Комбинация Ki-67 + p16 (диффузная) повышала специфичность до 91,3% при сохранении чувствительности 94,7%.

Аномальная экспрессия p53 (>10% положительных клеток) выявлена у 28,3% в групппе II против 11,4% в группе I (p<0,001). По степеням CIN: 16,7% – CIN I, 28,6% – CIN II, 43,3% – CIN III. Среди изученных ИГХ-маркеров p53 демонстрировал наименьшую диагностическую ценность (AUC 0,80), что согласуется с его ролью как маркера прогрессии, а не ранней неоплазии. Тем не менее, в составе интегрированного алгоритма p53 >10% добавлял 1,7% к специфичности по сравнению с комбинацией p16 + Ki-67.

АСМ-исследование выявило достоверные различия в нанотопографии поверхности эпителия между группами (табл. 1). Средняя высота рельефа Ra снизилась с 1,13±0,28 мкм в группе I до 1,18±0,13 мкм при CIN I (незначительно, p=0,31), 0,96±0,22 мкм при CIN II (p=0,02) и 0,74±0,27 мкм при CIN III (p<0,001). Такая динамика отражает постепенное разрушение организованной микропапиллярной архитектуры при нарастании степени CIN.

Размер клеток по данным АСМ увеличивался: 7,28±0,75 мкм – в группе I, 8,14±0,82 мкм – при CIN I, 10,12±1,24 мкм – при CIN II, 11,62±1,74 мкм – при CIN III, p<0,001. Корреляционный анализ Спирмена выявил значимые взаимосвязи: высота рельефа обратно коррелировала с p16-экспрессией (ρ=-0,82, p<0,001), Ki-67 (ρ=-0,76, p<0,001) и p53 (ρ=-0,61, p<0,001). Размер клеток по АСМ прямо коррелировал с Ki-67 (ρ=0,73) и толщиной эпителия (ρ=0,78, оба p<0,001). Выявленные корреляции свидетельствуют о том, что молекулярные изменения (нарушение Rb-пути) непосредственно отражаются в нанотопографии поверхности (рис. 3).

Таблица 2. Диагностическая точность отдельных маркеров и их комбинаций (ROC-анализ, AUC для CINII+)

ROC-анализ продемонстрировал, что наибольшей диагностической ценностью среди одиночных маркеров обладала толщина эпителия (AUC 0,94), за которой следовали площадь ядра (0,93) и расстояние до капилляров (0,91). Среди ИГХ-маркеров Ki-67 превосходил p16 (AUC 0,87 vs 0,84) и p53 (AUC 0,80). Сравнение AUC методом DeLong подтвердило статистически значимое превосходство полной модели над каждым из одиночных маркеров (все p<0,01).

Интегрированный алгоритм, включающий 6 параметров (p16 диффузная, Ki-67 >20%, p53 >10%, высота рельефа АСМ <0,85 мкм, ЯЦО >0,60, толщина эпителия >300 мкм), обеспечил AUC 0,97 (95% ДИ 0,95–0,99), чувствительность 97,3% и специфичность 95,1% для диагностики CIN II+ (табл. 2). При этом ПЦП составила 94,3%, ПЦО – 98,1%, что свидетельствует о высокой клинической применимости алгоритма (рис. 4).

Обсуждение

Настоящее исследование является одной из наиболее крупных работ, комплексно оценивающих диагностический потенциал трех ИГХ-маркеров в сочетании с АСМ-нанотопографией при CIN в предменопаузальной когорте (n=402). Полученные данные имеют ряд принципиально новых аспектов.

Во-первых, показана значимая корреляция (ρ=-0,82) между нанотопографическим параметром (высотой рельефа АСМ) и молекулярным маркером (p16INK4a). Это означает, что изменения поверхностной архитектуры клеток – явление физическое и наблюдаемое – выступают прямым отражением нарушений на уровне регуляции клеточного цикла. По нашим данным, снижение рельефа начинается с CIN II (0,96 мкм), тогда как при CIN I значение практически не отличается от нормы (1,18 vs 1,13 мкм), что делает этот параметр более специфичным, чем чувствительным маркером ранних стадий.

Во-вторых, диффузная экспрессия p16 при CIN III достигла 90,0% – результат, несколько превышающий данные большинства европейских центров (75–85%) [7, 8]. По всей видимости, это связано с высокой распространенностью ВПЧ 16/18 в нашей когорте (89,4%), которая выше, чем в сопоставимых исследованиях. Комбинация диффузной p16 и Ki-67 >20% в нашей работе обеспечила специфичность 91,3%, что сопоставимо с результатами регистрационного испытания CINtec® Plus (специфичность – 84–93%) [8].

В-третьих, интегрированный 6-параметрический алгоритм с AUC 0,97 демонстрирует реальную перспективу создания объективной, operator-independent системы диагностики CIN. Традиционная цитология в предменопаузе имеет чувствительность 55–70% [4, 5]; наш подход обеспечивает 97,3%, превосходя даже наиболее чувствительные одиночные маркеры. Это особенно актуально для регионов с высокой нагрузкой на онкологическую службу и ограниченными возможностями скрининга, таких как Узбекистан.

В-четвертых, открытие сильной корреляции между АСМ-рельефом и Ki-67 (ρ=-0,76) указывает на перспективу разработки неинвазивных или минимально инвазивных методов диагностики на основе нанотопографического анализа клеток, полученных при жидкостной цитологии, что может существенно расширить применение метода.

Следует обратить внимание, что исследование имеет одноцентровой дизайн, что ограничивает обобщаемость результатов. АСМ в настоящее время требует специализированного оборудования и квалифицированных операторов, что затрудняет ее внедрение в рутинную практику. Размер подгруппы CIN III (n=30) относительно невелик для построения многофакторных моделей. Отсутствие динамического наблюдения не позволяет оценить предиктивную ценность алгоритма в отношении прогрессии CIN.

На основе полученных данных нами разработан прогностический алгоритм ведения пациенток в предменопаузе: при диффузной p16 и Ki-67 >20% в сочетании со снижением рельефа АСМ <0,85 мкм рекомендуется выполнение петлевой электроэксцизии (LEEP) или конизации без предварительного наб-людения. Алгоритм проходит проспективную клиническую валидацию в трех медицинских учреждениях Узбекистана.

Выводы:

1. Диффузная экспрессия p16INK4a является наиболее чувствительным ИГХ-маркером неопластической трансформации: выявлена у 65,4% пациентов в группе II (против 21,5% в группе I, p<0,001) и нарастает по степеням CIN (52,1% → 90,0%).

2. Индекс Ki-67 достоверно возрастает с прогрессированием CIN (8,3±4,2% → 52,6±12,1%), а порог >20% обеспечивает чувствительность 78,0% и специфичность 85,0% (AUC 0,87) для диагностики CIN II+.

3. АСМ-нанотопография выявила прогрессивное снижение высоты рельефа поверхности (1,13±0,28 → 0,74±0,27 мкм), обратно коррелирующего с p16-экспрессией (ρ=-0,82, p<0,001) и Ki-67 (ρ=-0,76). Корреляция свидетельствует о том, что молекулярные изменения непосредственно отражаются в нанотопографии клеток.

4. Интегрированный диагностический алгоритм из 6 параметров (p16, Ki-67, p53, рельеф АСМ, ЯЦО, толщина эпителия) обеспечил AUC 0,97, чувствительность 97,3% и специфичность 95,1% для CIN II+ – показатели, значительно превосходящие стандартный цитологический скрининг.

5. Предложенный алгоритм представляет собой перспективную основу для разработки объективного, многопараметрического диагностического стандарта при обследовании женщин в предменопаузе с аномальными результатами скрининга шейки матки.

ЛИТЕРАТУРА

1. Bray F., Laversanne M., Sung H., et al. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries // CA Cancer J Clin. – 2024. – Vol.74, N3. – P.229–263. doi: 10.3322/caac.21834

2. World Health Organization. Global strategy to accelerate the elimination of cervical cancer as a public health problem. – Geneva: WHO, 2020.

3. Rim S.H., Znaor A., Cubo E., et al. Global cervical cancer incidence trends 2008–2017: analysis of 162 countries // Br J Cancer. – 2022. – Vol.127, N12. – P.2228–2238. doi: 10.1038/s41416-022-01986-1

4. Perkins R.B., Guido R.S., Castle P.E., et al. 2019 ASCCP risk-based management consensus guidelines for abnormal cervical cancer screening tests // J Low Genit Tract Dis. – 2020. – Vol.24, N2. – P.102–131. doi: 10.1097/LGT.0000000000000525

5. Wentzensen N., Schwartz L., Zuna R.E., et al. Performance of p16/Ki-67 immunostaining to detect cervical cancer precursors in a colposcopy referral population // Clin Cancer Res. – 2012. – Vol.18, N15. – P.4154–4162. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-12-0270

6. Hamod A., Alagaili A., Al-Zahrani A., et al. Prospective evaluation of cytology, CINtec® and PD-L1 as diagnostic biomarkers for cervical cancer screening // J Clin Med. – 2026. – Vol.15, N3. – P.1171. doi: 10.3390/jcm15031171

7. Huang J.L., Bao Y.Q., Yao Y.Q., et al. p16INK4a as a surrogate marker of high-risk HPV infection in cervical intraepithelial neoplasia: systematic review // Diagn Pathol. – 2023. – Vol.18, N1. – P.48. doi: 10.1186/s13000-023-01333-7

8. Bergeron C., Ordi J., Schmidt D., et al. Conjunctive p16INK4a testing significantly increases accuracy in diagnosing high-grade cervical intraepithelial neoplasia // Am J Clin Pathol. – 2010. – Vol.133, N3. – P.395–406. doi: 10.1309/AJCPXFLB4BRMRWMV

9. Gustafsson L., Ponten J., Bergstrom R., Adami H.O. International incidence rates of invasive cervical cancer before cytological screening // Int J Cancer. – 1997. – Vol.71, N2. – P.159–165. doi: 10.1002/(SICI)1097-0215(19970410)71:2<159::AID-IJC6>3.0.CO;2-0

10. Gama Goicochea L.M., Alas M.P. Nanotopographic characterization of cervical cells using atomic force microscopy // Sci Rep. – 2015. – Vol.5. – P.13218. doi: 10.1038/srep13218

11. Garcia P.D., Guerrero C.R., Garcia R. Nanorheology of living cells measured by AFM-based force-distance curves // Nanoscale. – 2020. – Vol.12, N16. – P.9133–9143. doi: 10.1039/D0NR00946F

12. Yang Z., Zhang Y., Yang L. Atomic force microscopy analysis of dysplastic cervical tissue // Pol J Pathol. – 2013. – Vol.64, N3. – P.212–218. doi: 10.5114/pjp.2013.34599

13. Mandal S., Das P., Shrinivas J., et al. Concurrent p16INK4a and Ki-67 expression in cervical intraepithelial neoplasia and cervical carcinoma // J Gynecol Pathol. – 2019. – Vol.38, N3. – P.207–213. doi: 10.1097/PGP.0000000000000617

14. Sharipova A., Raimnazarova G., Turgunov B., et al. Immunohistochemical markers in cervical intraepithelial neoplasia among peri-menopausal women in Uzbekistan // J Gynecol Oncol. – 2025. – Vol.36. – e7. doi: 10.3802/jgo.2025.36.e7

15. Hamod A., Popovici R., Oancea M., et al. Vaginal Microbiota Composition and HPV Genotype-Specific CIN2+ Risk: A Cross-Sectional Study // Diagnostics. – 2026. – Vol.16, N9. – P.1387. doi: 10.3390/diagnostics16091387

_______________________________________________________________________________________________________________________________

Конфликт интересов: автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Информация об авторе:

Реймназарова Гулсара Джамаловна – кандидат мед. наук, доцент кафедры физиологии и патологии Ташкентского государственного медицинского университета, e-mail: wwwgulsarareymnazarova@gmail.com, ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9857-6504

__________________________________________________________________________________

Медицинские новости. – 2026. – №8. – С. 92-96.

Внимание! Статья адресована врачам-специалистам. Перепечатка данной статьи или её фрагментов в Интернете без гиперссылки на первоисточник рассматривается как нарушение авторских прав.