Впоследние годы пристальное внимание ученых всего мира привлекают цитокины — полипептидные соединения, продуци­руемые клетками иммунной системы и выполняющие роль коммуни­кационных факторов межклеточного взаимодействия [5, 95].

Наиболее активно изучается один из цитокинов — фактор некроза опухолей [8, 54, 55, 82].

История его открытия началась в конце XIX в., когда было обнару­жено, что развитие бактериальной инфекции у раковых больных иногда приводило к уменьшению размеров или даже к исчезновению злокаче­ственных опухолей. Были предприняты попытки лечения раковых больных путем экспериментального заражения их живыми возбудите­лями инфекционных заболеваний. Однако в то время еще не были известны эффективные противомикробные средства, и каждое зараже­ние больных таило в себе риск генерализации инфекции.

Американский хирург W. Coley установил, что регрессию опухолей могут вызвать не только живые, но и убитые микроорганизмы. В 1903 г. на основе убитых бактерий им были разработаны специальные вакцины — "токсины Коли", которые он применял для лечения рака. После введения "токсинов Коли" у пациентов повышалась температура, появлялся озноб, а злокачественные опухоли уменьшались в размерах или даже исчезали. Однако результаты плохо воспроизводились (как и при заражении живыми бактериями), и предложенный метод лечения раковых больных не получил признания у врачей.

Интерес к потенциальной возможности использования микроорганизмов для лечения раковых заболеваний возобновился в середине XX в., когда было установлено, что регрессию опухолей могут вызывать только грамотрицательные бактерии. В 1943 г. ученые Национального института рака (США) выделили биологически активный компонент оболочки грамотрицательных микроорганизмов, состоящий из остат­ков жирных кислот, фосфора и сахаров и получивший название липополисахарида (ЛПС). Было установлено, что введение его мы­шам в низких дозах сопровождается лихорадкой и геморрагичес­ким некрозом опухолей, а в высоких — развитием шока и гибелью животных (токсичностью обусловлено второе название ЛПС — эндотоксин).

Детальное изучение противоракового действия ЛПС показало, что он способен вызывать некроз опухоли только in vivo и практически не действует на раковые клетки in vitro. Этот факт натолкнул исследова­телей на мысль о том, что тумороцидной активностью обладает не сам эндотоксин, а какие—то биологически активные вещества, образование которых в организме он индуцирует [1, 45, 53]. Дальнейший научный поиск опухолецидных агентов увенчался успехом, и в середине 70—х годов группой американских ученых был открыт фактор некроза опу­холей, который продуцируется моноцитами и макрофагами мышей, активированными ЛПС [10, 15, 45].

Почти одновременно был выделен еще один тумороцидный агент, который секретируется Т—лимфоцитами. Оба фактора близки (но не идентичны) по химическому строению, способности вызывать гемор­рагический некроз опухолей, однако отличаются проявлением биоло­гической активности в организме [57, 72].

Тумороцидный фактор, продуцируемый клетками моноцитарно—макрофагального ряда, получил название альфа—ФНО, или кахектина (за свою способность вызывать кахексию), а Т—лимфоцитами — бета—ФНО, или лимфотоксина.

В настоящей работе дана характеристика альфа—фактора некроза опухолей, который в дальнейшем для краткости будем именовать ФНО.

Ранние исследования были посвящены выяснению продукции ФНО и его роли в организме. Установлено, что опухолецидный полипептид вырабатывается не только у мышей [67], но и у крыс [34], кроликов [64], морских свинок [18], собак, коров, телят [73], овец [92], лошадей [71], коз [86], обезьян и человека [77]. Видовой специфичности опухолецидной активности фактора не выявлено [77].

Общепринятым методом определения ФНО является цитотоксический биотест, основанный на способности цитокина вызывать лизис клеток чувствительных штаммов L—929 мышиных фибробластов [19, 47, 48] или клона 13—клеточной линии WEHI—164 [49]. Биологическую активность его выражают в единицах действия (ЕД).

В последние годы для определения ФНО чаще используют радиоим­мунные, иммуноферментные методы. На ранних этапах изучения полагали, что единственный продуцент ФНО — мононуклеарные фаго­циты [11], поэтому он был назван монокином, т.е. биологически активным веществом, образуемым клетками моноцитарно—макрофа—гального ряда [10, 14, 18]. Позже представления о продуцентах ФНО значительно расширились, поскольку было установлено, что он в небольших количествах секретируется В—лимфоцитами [93, 96], Т—лимфоцитами [90], естественными киллерными клетками [21], полиморфноядерными лимфоцитами [81], тучными клетками и базофилами [32], астроцитами и микроглией [18], фибробластами [2, 87], кератиноцитами [76, 83], клетками эндотелия сосудов, волосяных фолликулов и протоков потовых желез [13, 76], яичников [62], гладкомышечными клетками сосудов [91]. Имеются сведения о спонтанной продукции небольших количеств тумороцидного полипептида некоторыми опухо­левыми клетками [16, 93].

Несмотря на способность многих клеток продуцировать ФНО, основной источник его в организме — мононуклеарные фагоциты [46]. Следует отметить, что макрофагальные клетки разной локализации различаются по способности продуцировать ФНО. Наиболее активно этот процесс происходит в альвеолярных селезеночных и нодулярных макрофагах, менее активно — в перитонеальных и интерстициальных [94]. Не выявлено различий цитокинпродуцирующей активности мононуклеарных фагоцитов у животных разных возрастных групп.

Интактные макрофаги продуцируют сравнительно небольшие коли­чества ФНО.

Стимуляцию биосинтеза тумороцидного монокина в организме могут вызывать агенты самой разнообразной природы. Наиболее актив­ным специфическим индуктором продукции ФНО является ЛПС [11, 12, 15, 45]. Уже в малых дозах он активирует макрофаги и усиливает образование монокина не только in situ [l, 73], но и в клеточных культурах [6, 19].

Многочисленными исследованиями показано, что широкий спектр биологических эффектов ЛПС (опухолецидное действие, лихорадка, диарея, тахикардия, кахексия, лейкопения и др.) обусловлен продукци­ей ФНО [1, 92].

Большой интерес для исследователей представляет выяснение механизмов активации мононуклеарных фагоцитов под действием эндоток­сина. В свете его понимания следует искать пути для предотвращения тяжелых осложнений при заболеваниях, вызванных грамотрицательными микроорганизмами.

Удалось установить, что в интактных мононуклеарах имеет место транскрипция гена монокина и в цитоплазме клеток можно выявить небольшое количество мРНК для ФНО. Однако процесс трансляции резко замедлен, цитокин синтезируется в ничтожно малых количествах, необходимых лишь для осуществления нормальных регуляторных про­цессов в иммунной системе, и в кровоток не поступает.

Когда в кровь попадает ЛПС, то он связывается со специфическим белком LBP (от англ. lipopolysaccharide—binding protein), и образовав­шийся комплекс действует на специфические рецепторы, представ­ляющие собой молекулы CD 14, которые экспрессированы на мононук­леарных фагоцитах. Результатом этого взаимодействия является увели­чение трансляции гена в 3 раза, уровня мРНК для ФНО — в 100 раз, а продукции монокина — в 1000 раз [8].

Процесс продукции монокина под влиянием ЛПС происходит довольно быстро. Так, в культуре мононуклеарных фагоцитов уже через несколько минут после начала инкубации эндотоксин вызывал выра­женную экспрессию мРНК для ФНО, которая достигала максимума через 1—2 ч [49]. Секреция монокина в инкубационную среду продол­жалась около 12 ч.

Для биосинтеза ФНО необходим постоянный контакт мононуклеаров с ЛПС. В опытах с культурой макрофагов показано, что после удаления эндотоксина из инкубационной среды синтез монокина немедленно прекращается, хотя уровень мРНК для ФНО в цитоплазме клеток остается высоким.

По—видимому, стимуляция продукции цитокина обусловлена в ос­новном усилением процесса трансляции уже экспрессированной мРНК для ФНО [88].

У кроликов ФНО проявлялся в плазме через 20 мин после внутри­венной инъекции ЛПС, а максимум активности монокина отмечался через 1,5—2 ч, затем, его содержание резко падало и еще через 1,5—2 ч достигало исходного уровня. На пике продукции содержание туморо­цидного полипептида в крови может достигать микромолярных кон­центраций. Учитывая очень короткий период полувыведения ФНО, можно полагать, что высокий уровень его в плазме отражает суммарную продукцию фактора некроза опухолей в нескольких миллиграммах на 1 кг массы тела [9].

У мышей после внутривенного введения ЛПС цитотоксический монокин определяется в плазме крови через 10—15 мин, его содержание достигает максимума через 1 ч после инъекции, а спустя 3—4 ч падает до исходного уровня [96].

Активирующее действие эндотоксина на продукцию ФНО значи­тельно усиливалось у животных, примированных зимозаном или вак­циной Кальметга— Герена (BCG, или БЦЖ) [80]. Сам ФНО может выступать в качестве примирующего сигнала в активации покоящихся макрофагов [20]. После воздействия ЛПС на макрофаги, предваритель­но обработанные ФНО в концентрации 100 ЕД/мл, его продукция возрастала в 5 раз по сравнению с контролем.

Установлено, что синтез ФНО стимулирует не вся молекула ЛПС, а только ее активный компонент — липид А, состоящий из глюкозамина, соединенного с фосфорными группами и остатками жирных кислот [36]. Получены синтетические аналоги липида А, которые активно высвобождают монокин in vivo и in vitro [85].

Помимо ЛПС продукцию ФНО стимулируют многие другие агенты. Особенно активны в этом отношении некоторые цитокины. Так, гамма—интерферон (γ—ИФ), секретируемый лимфоцитами, усиливает биосинтез тумороцидного полипептида мононуклеарными фагоцита­ми и гранулоцитами [20]. Установлено, что он стимулирует экспрессию мРНК для ФНО и процесс трансляции. Полагают, что продукция ФНО играет важную роль в проявлении тумороцидной активности интерферона.

Интерлейкин—2 (ИЛ—2), синтезируемый Т—хелперными лимфоцита­ми, является активным стимулятором продукции ФНО [38]. Особенно выраженное потенцирование этого процесса наблюдалось при комби­нации ИЛ—2 с γ —ИФ [20] или гранулоцитарно—макрофагальным колониестимулирующим фактором [35]. Последний способен также самостоятельно стимулировать продукцию ФНО [20, 35]. Аналогичным действием обладает и интерлейкин—3 [35].

Активируют синтез цитотоксического монокина иммуноглобулины G [39], активаторы протеинкиназы С [78], нейропептиды Р и К [24], фактор активации тромбоцитов [80], цГМФ [29], а также компоненты комплемента С5а [37], которые потенцируют действие   эндотоксина.

Витамин D и его гормональная форма — 1,25—дигидровитамин D повышают продукцию ФНО. Полагают, что стимулирующее действие их реализуется через значительное усиление экспрессии гена молекул CD 14, известных как высокоаффинный рецептор ЛПС на поверхност­ной мембране макрофагов [47].

Весьма активные индукторы секреции ФНО — форболовые эфиры [3], иммуномодуляторы [78], лектины типа конканавалина А [3, 12], пептидогликаны, водорастворимая фракция прополиса [22].

Особое место как активаторы мононуклеарных фагоцитов и стиму­ляторы продукции ФНО занимают органические соединения микроб­ного происхождения, поскольку монокин в эволюционном плане выполняет защитную роль, повышая резистентность организма к чуже­родным агентам (опухолевым, инфекционным и др.).

Усиление биосинтеза монокина происходит при инфицировании Pseudomonas aeruginosa [79], Nocardia rubra, Corinebacterium parvum [19], Helicobacter pylori [17], Mycobacterium leprae [89], Mycobacterium avium intracellulare [7], Salmonella typhimurium [41], Staphylococcus aureus [27]. По—видимому, их индуцирующий эффект обусловлен ЛПС клеточных оболочек.

Без посреднической роли эндотоксина усиливается продукция монокина при инфицировании микоплазмами [61], вирусом гриппа и цитомегаловирусом [31], которые не имеют клеточной стенки и, следо­вательно, не содержат ЛПС. Полагают, что биологически активные метаболиты вирусов и микоплазм индуцируют биосинтез цитокина на уровне транскрипции. Они либо стимулируют активаторы или блоки­руют репрессоры этого процесса, либо стабилизируют распад мРНК для ФНО [61].

Индуцируют продукцию цитотоксического монокина и вещества неорганической природы: соли меди и цинка [70], цисплатина [74], частицы кремния и асбестовые волокна [23].

В качестве активаторов монокинпродуцирующих клеток могут вы­ступать и нематериальные факторы. Так, интенсивные физические упражнения (забег на 5 км) вызывают у людей значительное и длитель­ное (до 24 ч) повышение содержания ФНО в крови [25].

Ингибируют продукцию опухолецидного полипептида вещества различной природы, наиболее активные из них — продуценты иммун­ной системы: интерлейкин—6 [43], интерлейкин—4 [52], интерлейкин—1β [42], а также ингибиторы синтеза белка — циклогексимид [88] и др.

Общеизвестно, что любой процесс в организме требует энергетичес­кого обеспечения. Центральным звеном регуляторных внутриклеточ­ных механизмов энергообразования является система циклических нуклеотидов. От соотношения уровней цАМФ и цГМФ в клетке зависит активирование или ингибирование ответной реакции на сти­мул. Повышение содержания цАМФ приводит к торможению поступ­ления Са⁺⁺   в клетку или даже способствует его выведению, что сопровождается уменьшением продукции ФНО [29]. Ингибиторы фосфодиэстеразы (пентоксифиллин и др.), способствующие накоплению цАМФ, угнетают продукцию ФНО [6]. Противоположный эффект вызывает цГМФ, повышающий внутриклеточный уровень кальция, который стимулирует активацию протеинкиназ и фосфорилирование белков, что в конечном итоге приводит к повышению функциональной активности клетки [29].

В тесной связи с циклическими нуклеотидами находится простагландиновая система, играющая роль эндогенного регулятора монокина. Под влиянием простагландина Е₂ увеличивается содержание цАМФ в цитоплазме макрофагов и, как следствие, тормозится продукция ФНО [75].

Ингибиторы липооксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты, способствующие образованию простагландинов, блокируют продукцию монокина in vitro и in situ [68].

Мощное ингибирующее действие на биосинтез ФНО оказывают глюкокортикостероиды, блокирующие процесс транскрипции в клетке [56]. Предварительное введение мышам дексаметазона перед инъекци­ей эндотоксина нивелировало эффект последнего в отношении продук­ции монокина [96]. Динамика снижения уровня ФНО, повышенного вследствие введения животным ЛПС, четко корригировала с содержа­нием эндогенных кортикостероидов в крови [96]. Доказательства роли эндогенных стероидов в регуляции продукции тумороцидного монокина были получены в экспериментах на адреналэктомированных и гипофизэктомированных мышах, у которых уровень ФНО был повышен спустя 5 ч (у здоровых животных не более 2—3 ч) после инъекции эндотоксина.

Угнетают биосинтез монокина многие лекарственные средства, обладающие иммуносупрессивным эффектом [66]. Такая активность выявлена у препаратов золота [41] и других медленнодействующих противоревматических средств: циклоспорина А [59], циклофосфамида, алкалоидов тетрандрина [27] и колхицина [56], ципрофлоксацина [60].

Гистамин, возбуждая Н₂—рецепторы, вызывает дозозависимую ингибицию продукции ФНО, индуцированного ЛПС. Преинкубация взвеси моноцитов с циметидином, но не с H₁—блокаторами, предотвра­щала блокирующий эффект биогенного амина [26].

ФНО обладает высокой биологической активностью [4, 14, 56, 77, 82]. Его эффекты опосредуются через высокоспецифические клеточ­ные рецепторы [28, 44].

Все клетки организма (за исключением эритроцитов) содержат на своей поверхности (аффинитет порядка 3 х10⁹ м^—1) рецепторы для ФНО [28, 63]. Их количество может колебаться от нескольких сотен до десятков тысяч на клетку и значительно увеличивается при ее актива­ции [43].

Специфический рецептор состоит из трех субъединиц: поверхност­ной, мембранассоциированной и внутриклеточной [40]. Наибольший интерес для исследователей представляет экстрацеллюлярный лигандсвязывающий домен, расположенный на клеточной поверхности, подобно волоску на коже. Он легко отделяется от клеточной мембраны и выделяется в растворенном виде [50].

С помощью моноклональных антител была выявлена экспрессия на мембране двух видов растворимых рецепторов [44]. Выделяют поверх­ностные рецепторы I типа с молекулярной массой 55 кД и II типа — 75 кД [51]. Оба типа рецепторов могут локализоваться на одной [33] или на разных клетках организма [65]. Так, в коже на кератиноцитах обнаружены только рецепторы с молекулярной массой 55 кД, а на клетках Лангерганса — 55 и 75 кД [51].

Методом поточной цитометрии с помощью моноклональных анти­тел показано, что на покоящихся В—лимфоцитах имеется сравнительно немного рецепторов для ФНО с молекулярной массой 75 кД. При активации клеток их количество значительно возрастает [90]. Экспрес­сия же рецепторов I типа низка как на покоящихся, так и на стимули­рованных В—лимфоцитах и на клетках Т—лимфомы человека [65].

Взаимодействие ФНО с поверхностными рецепторами вызывает неоднозначные эффекты [44]. В зависимости от типа клеток и их физиологического состояния монокин может либо подавлять рост и оказывать цитотоксическое действие [30], либо стимулировать их пролиферацию и дифференцировку. Полагают, что существует распре­деление на цитотоксический и пролиферативный эффекты между разными типами рецепторов [33].

Медиаторы иммунного ответа ИЛ—2 и ИЛ—7 [51], а также γ—ИФ [84] способны индуцировать экспрессию рецепторов для ФНО. Стимуля­ция образования в клетках активных радикалов кислорода угнетает этот процесс [58].

Мембранассоциированный домен рецептора имеет молекулярную массу 138 кД и в растворимой форме не выделяется [40].

Процессы, протекающие на пострецепторном уровне, изучены не­достаточно. Схематически их можно выразить следующим образом. После связывания ФНО с рецептором происходит интернализация образовавшегося комплекса, который вызывает активизацию G—белков в цитоплазме. Это приводит к гидролизу фосфатидилинозитол—4,5—бифосфата с образованием двух вторичных внутриклеточных мессенджеров — инозитол—1,4,5—трифосфата (ИТФ) и диацилглицерола (ДАГ). ИТФ высвобождает из эндоплазматической сети ионы кальция, а ДАГ является внутриклеточным активатором протеинкиназы С. Повыше­ние уровня внутриклеточного кальция приводит к индукции ряда ферментов, включая кальций—кальмодулинзависимую протеинкиназу. Обе киназы фосфорилируют определенные белки, что ведет в конечном итоге к специфическому ответу клетки на действие ФНО [69].

Таким образом, к настоящему времени накоплен значительный феноменологический материал об активаторах и ингибиторах биосин­теза ФНО в организме, выявлены фрагментарные характеристики механизмов их действия. Очевидно, что истинная картина регуляции продукции монокина намного сложнее, и потребуются дополнитель­ные исследования, чтобы составить четкое представление об этом процессе.

Однако и имеющиеся сведения весьма ценны для теоретической и практической медицины, поскольку они расширяют наши представле­ния о функционировании естественной системы противоопухолевой и противоинфекционной защиты организма и позволяют использовать их в клинической практике для улучшения существующих методов лечения. Основываясь на материалах изучения спектра биологических эффектов эндотоксина и анализа роли ФНО в их реализации, нами было предложено использовать тест активации продукции монокина под воздействием ЛПС для оценки влияния различных препаратов на иммунологическую реактивность организма. Учитывая, что ФНО — главный эндогенный медиатор токсических и иммунобиологических проявлений действия эндотоксина, этот способ, по нашему мнению, представляет интерес для исследователей в качестве модели при изыскании средств повышения иммунологической устойчивости орга­низма к токсикоинфекциям и при оценке активности препаратов, модулирующих действие токсических агентов биологической природы.

Предложенный способ апробирован в лаборатории радиопатологии и в биофизической лаборатории Медицинского радиологического научного центра РАМН при изучении адаптогенных препаратов широ­кого спектра действия, повышающих общую неспецифическую реактивность организма,— женьшеня, элеутерококка и Cadilo Sarmatis. В экспериментах, проведенных на гибридных мышах, установлено, что все исследованные препараты в терапевтических дозах, оказывающие адаптогенный эффект по функциональным тестам при экстре­мальных воздействиях, приводят к существенному повышению устой­чивости к эндотоксину по тесту индукции ФНО. У мышей, по­лучавших адаптогенные препараты, обнаружено 2—4—кратное сниже­ние выхода ФНО в плазму крови, сопровождавшееся ослаблением общетоксических реакций при введении сублетальных доз эндотоксина.

Выявленный феномен торможения индукции ФНО под действием адаптогенов позволяет объяснить природу повышения устойчивости организма к эндотоксину и токсикоинфекциям различной этиологии. Знание механизмов активации мононуклеарных фагоцитов, сопровож­дающейся повышением продукции ФНО, послужит основанием для направленной стимуляции этого процесса у больных с онкологичес­кими и инфекционными заболеваниями. Для этих целей используют как отдельные активаторы продукции монокина, так и их комбина­ции.

На ранних этапах изучения ФНО было установлено, что в обычных условиях он продуцируется в малых количествах, выполняет свои функции локально (ауто— и паракринно) и в общий кровоток не поступает. При экстремальных ситуациях (шок, сепсис и т. д.) проис­ходит активация его биосинтеза, монокин может накапливаться в крови в значительных количествах и оказывать токсическое действие на организм. Для предотвращения подобной ситуации используют ингибиторы продукции тумороцидного фактора.