Внимание! Статья адресована врачам-специалистам

Tatyana Rudenkova, PhD, Leading Researcher of the Research Laboratory of the Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Minsk

Svetlana Kostiuk, MD, Professor, Chief Researcher of the Research Laboratory of the Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Minsk

Olga Poluyan, Researcher of the Research Laboratory of the Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Minsk

Natalia Yudina, MD, Professor, Head of the Department of General Dentistry of the Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Minsk

Margarita Iakovleva-Malykh, Assistant of the Department of General Dentistry, Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Minsk

Optimization of molecular biological analysis to identify the nucleotide sequences of the genetic determinants of IL-1ß, COL2A1, MMP-8 in patients with periodontal diseases

Цель. Разработка метода молекулярно-генетической идентификации вариантов генетических детерминант – генов, контролирующих синтез цитокинов, коллагена, металлопротеиназ в эпителиальных клетках полости рта, и проведение апробации на биологическом материале у пациентов с заболеваниями периодонта.

Материалы и методы. При разработке метода молекулярно-генетического анализа вариантов генетических детерминант в эпителиальных клетках полости рта исследования проводили с использованием биологического материала от пациентов с хроническим сложным периодонтитом (n=3) и хроническим простым периодонтитом (n=3), а также лиц с хроническим простым маргинальным гингивитом (контрольная группа, n=4).

Заключение. Для гена ИЛ-1b была выявлена замена А21521C в двух образцах. Для гена COL2A1 в одном образце были обнаружены замены C36245A и C36271A. Для гена MMP-8 в одном образце наблюдали замену G19137T.

Ключевые слова: периодонтит, генетические маркеры, цитокины, коллаген, металлопротеиназы.

Современная стоматология. – 2020. – №3. – С. 54–59.

Objective. Development of a method for molecular genetic identification of variants of genetic determinants – genes that control the synthesis of cytokines, collagen, metalloproteinases in epithelial cells of the oral cavity, and to conduct testing on biological material in patients with periodontal diseases.

Materials and methods. When developing a method for molecular genetic analysis of variants of genetic determinants in epithelial cells of the oral cavity, studies were carried out using biological material from patients with chronic complex periodontitis (n=3) and chronic simple periodontitis (n=3), as well as individuals with chronic simple marginal gingivitis (control group, n=4).

Conclusion. For the IL-1b gene, the A21521C substitution was detected in two samples. For the COL2A1 gene, substitutions C36245A and C36271A were found in one sample. For the MMP-8 gene, the G19137T substitution was observed in one sample.

Keywords: periodontitis, genetic markers, cytokines, collagen, metalloproteinases.

Sovremennaya stomatologiya. – 2020. – N3. – P. 54–59.

Одним из широко распространенных патологических воспалительных процессов полости рта является хронический периодонтит (пародонтит). Хронический периодонтит представляет собой воспалительное заболевание, приводящее к деструкции тканей периодонта и является основной причиной потери зубов у взрослого населения. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, 4–22% взрослого населения страдают периодонтитом тяжелой степени тяжести, 23–47% – периодонтитом средней степени тяжести и только у 1–8% населения периодонт остается интактным. Распространенность заболеваний периодонта среди взрослого населения по миру в целом оценивается на уровне 93–95% [1, 2].

Ведущая роль в развитии периодонтита принадлежит микробному фактору, однако выраженность воспалительной реакции в значительной мере определяется возможностями макроорганизма противостоять воздействию на него патогенной микрофлоры. В литературе представлен ряд публикаций, посвященных изучению факторов, которые не вызывают заболевание, но ассоциированы с тяжелым течением воспалительного процесса. К таким факторам относят и генетический статус человека [3].

Несмотря на проведенные многочисленные исследования, не установлено достоверных маркеров, которые позволяли бы проводить оценку предрасположенности конкретного пациента к развитию периодонтита или прогнозировать течение и исход заболевания. Разработка таких критериев позволит осуществлять раннюю диагностику и назначать адекватное обоснованное лечение пациентам с периодонтитом. Наиболее перспективным направлением в поиске маркеров предрасположенности и прогноза является идентификация генетических факторов, ассоциированных с риском развития, вариантом течения и исходом периодонтита [4].

Развитие и совершенствование молекулярно-генетических методов анализа дали возможность активно изучать геном человека, что позволило расширить поиск генов-кандидатов, полиморфизм которых мог быть связан с вероятностью возникновения, особенностями течения и исходом заболеваний [3]. Гены, кодирующие цитокины (интерлейкины (ИЛ), факторы роста, интерфероны, хемокины и др.), стали первыми генами-кандидатами, изменения в которых попытались связать с патогенезом воспалительных заболеваний, в том числе и воспалительных заболеваний периодонта. Так как продукты этих генов – цитокины – являются ключевым звеном иммунного ответа при любых воспалительных реакциях.

ИЛ-1b – провоспалительный цитокин, которому принадлежит ведущая роль в процессах острого и хронического воспаления как местного, так и системного характера. Секретируется преимущественно макрофагами, а также Т-лимфоцитами, фибробластами и клетками эпителия. Под влиянием липополисахаридов клеточной стенки периодонтопатогенной микрофлоры происходит стимуляция продукции ИЛ-1b макрофагами. Далее посредством аутокринных механизмов он сам активирует свою выработку. ИЛ-1? индуцирует продукцию матриксных металлопротеи-наз, тормозит синтез их ингибиторов, повышает функциональную активность остеокластов. Также установлено, что ИЛ-1b тормозит миграцию остеобластов. Напротив, угнетение ИЛ-1b сопровождается значительным замедлением «движения» воспалительного инфильтрата в сторону кости и подавлением ее потери. A. Bakker и соавт. (2009) сообщают, что данный цитокин вызывает апоптоз остеоцитов [8].

Повышенные уровни ИЛ-1b в десневой жидкости и слюне пациентов с хроническим периодонтитом напрямую взаимо-связаны с тяжестью поражений, а также клиническими симптомами заболевания [9]. По мнению ряда авторов, наличие корреляции между концентрацией ИЛ-1b и степенью тяжести воспалительных и деструктивных процессов в периодонте делает данный цитокин ценным диагностическим маркером патологии [10].

Еще одним направлением поиска генетических маркеров предрасположенности к заболеваниям периодонта стало изучение генов медиаторов воспаления, которые оказывают непосредственное влияние на течение воспалительного процесса. Гены матриксных металлопротеиназ – MMP-2, MMP-3, MMP-8 и MMP-9 – также могут быть изучены для выявления возможных генетических маркеров, ассоциированных с предрасположенностью к воспалительным заболеваниям периодонта, поскольку матриксные металлопротеиназы относятся к семейству внеклеточных протеиназ, основными функциями которых являются участие в обмене белков соединительной ткани, развитии и ремоделировании клеточного матрикса, репарации тканей, неоангиогенезе [11].

В последнее время было установлено, что повышенный уровень MMП-8, особенно в активной форме (аMMП-8), в жидкостях полости рта связан с воспалением (заболеваниями периодонта и при периимплантитах), особенно в клинически активных фазах. Периодонтальная дегенерация костной ткани вызвана интерстициальной коллагеназой MMП-8, а не бактериальными ферментами, MMП-8 высвобождается из нейтрофилов селективной дегрануляцией, запускаемой мощными периодонтопатогенными бактериями и их факторами вирулентности вместе с провоспалительными медиаторами хозяина [12, 13].

Фибробласты десны при стимуляции провоспалительными медиаторами, такими как интерлейкин (ИЛ-1b и фактор некроза опухоли a) могут продуцировать коллагенолитические ММП, включая ММП-8. Уровень активной ММП-8 отражает, предсказывает и связан с прогрессирующей активностью заболеваний периодонта и периимплантитом. Также установлена связь между повышением уровня аММП-8 в жидкостях полости рта (слюна, десневая жидкость) с клиническими параметрами периодонта, то есть с глубиной зондирования кармана, кровоточивостью при зондировании и потерей зубодесневого прикрепления [14, 15].

Цель исследования – разработать метод молекулярно-генетической идентификации вариантов генетических детерминант – генов, контролирующих синтез цитокинов, коллагена, металлопротеиназ в эпителиальных клетках полости рта, и провести апробацию на биологическом материале у пациентов с заболеваниями периодонта.

Материалы и методы

Исследования проводились на базе кафедры общей стоматологии Белорусской медицинской академии последипломного образования (БелМАПО), Научно-исследовательской лаборатории (НИЛ) БелМАПО (группа ПЦР-диагностики, отдел метаболической диагностики).

Объектами исследования явились пациенты с заболеваниями периодонта (пародонта). Были выделены следующие нозологические формы: хронический простой и сложный периодонтит, хронический простой маргинальный гингивит. При разработке метода молекулярно-генетического анализа вариантов генетических детерминант (гены, контролирующие синтез цитокинов, коллагена, металлопротеиназ) в эпителиальных клетках полости рта исследования проводили с использованием биологического материала от пациентов с хроническим сложным периодонтитом (n=3) и хроническим простым периодонтитом (n=3), а также лиц с хроническим простым маргинальным гингивитом (контрольная группа, n=4).

В качестве биологического материала у пациентов проводили взятие соскобов эпителиальных клетках полости рта. Для получения соскобного материала использовали стерильные бумажные штифты №40, полученный образец помещали в пробирку типа эппендорф объемом 1,5 мл, содержащую 200 мкл транспортной среды («ВекторБест», РФ). Пробирки замораживали и оставляли для хранения при температуре -18 ºС.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась при помощи компьютерной программы STATISTICA 10. При этом вид распределения переменных определяли с использованием критерия Колмогорова – Смирнова. Так как распределение значений переменных было отличным от нормального, для их описания использовали медиану и квартили (Me (Q25/Q75)). Для сравнения количественных показателей в исследуемых группах применялся критерий Манна – Уитни. При уровне значимости р<0,05 различия считались статистически достоверными.

Результаты и обсуждение

Для оптимизации метода выделения ДНК из соскобов эпителиальных клеток полости рта были использованы наборы для выделения нуклеиновых кислот «Проба-НК» («ДНК-технология», РФ), «Экстракция-100» («ВекторБест», РФ), «ДНК-сорб-В» («АмплиСенс», РФ) и метод классической фенол-хлороформной экстракции.

Для определения концентрации и степени чистоты выделенной ДНК из образцов биологического материала с использованием различных наборов реагентов проводили спектрофотометрические исследования (NanoDrop 1000, Thermo scientific, США), при этом определяли отношение поглощения на длинах волн 260 и 280 нм (А260/А280).

Метод выделения с использованием фенол-хлороформной экстракции был взят в качестве референсного. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Значения А260/А280, полученные при использовании различных наборов реагентов для выделения ДНК (Ме (Q_25/Q75))

Для чистого препарата ДНК с отсутствием примесей белка и других ингибиторов значение А260/А280 составляет 1,8. Достоверно более высокие значения А260/А280, близкие к значениям референсного метода (метод фенол-хлороформной экстракции), были установлены при использовании набора реагентов «Экстракция-100» (критерий Манна – Уитни, p<0,05).

После анализа полученных данных был сделан вывод, что для проведения дальнейших исследований по молекулярно-генетической идентификации вариантов генетических детерминант (гены, контролирующие синтез цитокинов, коллагена, металлопротеиназ) в эпителиальных клетках полости рта, оптимальным является использование набора реагентов «Экстракция-100» («ВекторБест», РФ).

На следующем этапе с использованием программного обеспечения Vector NTI и базы данных нуклеотидных последовательностей NCBIBLAST были подобраны пары праймеров (прямой (forward) и обратный (reverse)) для изучения нуклеотидных последовательностей генетических детерминант ИЛ-1?, COL2A1, MMP-8 (табл. 2).

Таблица 2. Последовательности праймеров для изучения генетических детерминант ИЛ-1?, COL2A1, MMP-8

Для всех геновбыли выбраны по три пары праймеров с целью найти оптимальные последовательности для достижения наилучшего результата при проведении молекулярно-генетического анализа.

Дизайн олигонуклеотидов, осуществленный поэтапно для каждого гена, контролирующего синтез ИЛ-1?, COL2A1, MMP-8, и последовательно для каждого выбранного гомологичного участка (c использованием бесплатного программного онлайн приложения Primer3 v.0.4.0 и бесплатного онлайн алгоритма mfold/DNAfold) позволил оценить вероятность образования вторичных шпилечных структур ампликона, а также вероятность стерических препятствий для связывания олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов и выбрать наиболее оптимальные варианты – 6 наборов: олигонуклеотидный праймер – флуоресцентно-меченый зонд – олигонуклеотидный праймер. С использованием онлайн приложения NCBI/Blast подтверждена высокая специфичность выбранных наборов олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов.

Для выбора гена, который будет использоваться в качестве внутреннего контроля, провели количественный анализ и расчет коэффициента вариации для house-keeping генов человека: NAGK, GAPDH, HGUS, b-актин. House-keeping гены человека присутствуют во всех клетках. Для оценки концентрации house-keeping генов человека использовали плазмидный стандарт, а затем рассчитывали коэффициент вариации (CV), исходя из полученных значений концентраций house-keeping генов [3, 4]. Амплификацию всех проб проводили в дублях, для расчета коэффициента вариации использовали средние значения концентраций, полученные в ходе исследования.

Для генов GAPDH, HGUS иb-актин рассчитанные значения коэффициентов вариации находились на уровне 6,9%, 10,5% и 19,4% соответственно.

В результате анализа полученных данных в качестве внутреннего контроля был выбран ген человека NAGK, так как именно для него было установлено самое низкое значение коэффициента вариации – 3,7%.

В ходе оптимизации состава амплификационной смеси были протестированы различные объемы внесения праймеров (от 1 до 2 мкл), ДНК (от 3 до 10 мкл) и воды.

По результатам исследований был выбран оптимальный состав амплификационной смеси, в который были включены 15,0 мкл 2Х Quick-Load Taq Master Mix; 1,5 мкл смеси эквивалентных концентраций праймеров (прямого и обратного) и зонда для идентификации исследуемого гена, 5,6 мкл воды и 8 мкл ДНК.

При оптимизации программы амплификации варьировали длительность горячего старта (от 5 до 15 мин); длительность этапа денатурации (от 10 до 20 с); длительность (от 30 до 60 с) и температуру (от 58 °С до 63 °С) этапа отжига; количество циклов амплификации (от 35 до 50).

По результатам проведенных исследований был выбран оптимальный вариант программы амплификации: 1 цикл: 95 ºС – 5 мин; 45 циклов: 95 ºС – 20 с, 60 ºС – 40 с.

Для анализа возможности использования подобранных праймеров, оптимизированного состава амплификационной смеси и программы амплификации при изучения нуклеотидных последовательностей генетических детерминант ИЛ-1?, COL2A1, MMP-8 проводили постановку классической ПЦР с дальнейшей визуализацией результата методом электрофореза. Пробы ставили в дублях. Результаты, полученные в ходе выполнения данного этапа, представлены в таблице 3.

Таблица 3. Результаты обнаружения изучаемых участков генетических детерминант

в биологическом материале обследованных пациентов (n=10)

Результат выявления/отсутствия амплификации последовательности таргетного гена в каждом образце считался валидным (положительным или отрицательным) при условии, что для данного образца был установлен факт успешной амплификации для гена внутреннего контроля NAGK. В случае, если результат амплификации для гена NAGK был отрицательным, образец подвергался повторному анализу, начиная с этапа выделения ДНК.

В ходе проведения исследований на биологическом материале пациентов (n=10) во всех пробах была выявлена амплификация референсного генаNAGK. При анализе данных об амплификации таргетных генов было установлено, что использование подобранных пар праймеров ИЛ-1?-1 (1608 п.о.) и COL2A1-1 (1342 п.о.) позволяет получать ампликоны таргетных участков генов ИЛ-1? и COL2A1 в 100% случаев. Поэтому именно эти последовательности были выбраны для проведения дальнейших молекулярно-генетических исследований.

Для гена MMP-8 последовательности праймеров MMP-8-2 (1144 п.о.) и MMP-8-3 (1063 п.о.) позволяли амплифицировать таргетные участки гена в 90% и 80% случаев соответственно, при этом пробы, в которых результат, полученный с использованием праймеров MMP-8-2, был отрицательным, стали положительны при использовании праймеров MMP-8-3. Поэтому для дальнейших исследований было решено использовать две пары праймеров: MMP-8-2 – как основную и MMP-8-3 – как дополнительную, при отрицательном результате, полученном с использованием основной пары праймеров.

В ходе выполнения этапа электрофоретического анализа дополнительно проводили оценку уровня амплификации неспецифических фрагментов ДНК. Во всех проанализированных образцах на электрофореграмме присутствовали четкие полоски на уровне детекции специфических фрагментов ДНК гена NAGK и изучаемых генов, в соответствии с маркером молекулярного веса.

После проведения электрофореза из геля вырезали фрагменты, содержащие фрагменты изучаемых генов. Затем ДНК извлекали из геля с использованием набора реагентов QIAquick Gel extraction kit (Qiagen, Германия) для проведения секвенирования с целью анализа нуклеотидной последовательности полученных фрагментов ДНК.

Сиквенс-анализ проводили с использованием набора реагентов BigDyeTerminatorCycleSequencingkitv3.1 (AppliedBiosystems, США), отдельно с forward- и revers-праймером для каждого гена, чтобы проанализировать последовательность нуклеотидов в двух направлениях. Секвенированные фрагменты ДНК подвергались очистке с использованием набора реагентов DyeEx 2.0 Spin kit (Qiagen, Германия) и последующему сиквенс-анализу на генетическом анализаторе ABI Prism 310 (AppliedBiosystems, США).

Полученные данные о нуклеотидной последовательности образцов сравнивали с зарегистрированными последовательностями идентифицируемых генов в online поисковой системе BLAST (www.ncbi.nlm.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html) для идентификации принадлежности той или иной последовательности определенному гену [5]. Затем проводили поиск и идентификацию нуклеотидных замен.

В качестве референсных использовали зарегистрированные нуклеотидные последовательности: ИЛ-1? – Human interleukin 1-beta (IL1B) gene, complete cds, GenBank: M15840.1; COL2A1 – Homo sapiens collagen type II alpha 1 chain (COL2A1), RefSeqGene on chromosome 12, GenBank: NG_008072.1; MMP-8 – Homo sapiens matrix metallopeptidase 8 (MMP8), RefSeqGene on chromosome 11, GenBank: NG_012101.1.

В ходе изучения нуклеотидных последовательностей генов ИЛ-1?, COL2A1, MMP-8 у обследованных пациентов были выявлены замены одного и двух нуклеотидов в 3 образцах (табл. 4).

Таблица 4. Нуклеотидные замены в последовательностях ИЛ-1?, COL2A1, MMP-8

Для гена ИЛ-1? была выявлена замена А21521C в двух образцах. Для гена COL2A1 в одном образце обнаружены замены C36245A и C36271A. Для гена MMP-8 в одном образце наблюдали замену G19137T.

По итогам исследования выявлено, что чувствительность ПЦР-анализа при установленных оптимальных параметрах реакции зависит от процедуры пробоподготовки исследуемого биологического материала, включающей экстракцию нуклеиновых кислот. Благодаря этому происходит не только концентрирование исследуемой матрицы ДНК в малом объеме, но и удаление ингибиторов ПЦР. При этом определенная специфика ингибиторов характерна для конкретных разновидностей биологического материала. Наибольшее снижение диагностической эффективности ПЦР происходит на этапах, связанных с эффективностью лизиса клинического материала и экстракцией ДНК/РНК, с деградацией ДНК/РНК-матрицы. Низкая эффективность ПЦР может определяться образованием сложных комплексов ДНК-белка, что обусловливает появление дополнительных полос на этапе электрофоретической детекции результатов, вызванное фрагментированием ДНК-мишени. Нами подтверждено, что использование набора реагентов «Экстракция-100» («ВекторБест», РФ) является оптимальным для проведения исследований по молекулярно-генетической идентификации вариантов генетических детерминант (гены, контролирующие синтез цитокинов, коллагена, металлопротеиназ) в эпителиальных клетках полости рта человека.

Заключение

Для всех геновбыли выбраны по три пары праймеров с целью найти оптимальные последовательности для достижения наилучшего результата при проведении молекулярно-генетического анализа. Дизайн олигонуклеотидов, осуществленный поэтапно для каждого гена, контролирующего синтез ИЛ-1?, COL2A1, MMP-8, и последовательно для каждого выбранного гомологичного участка позволил оценить вероятность образования вторичных шпилечных структур ампликона, а также вероятность стерических препятствий для связывания олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов и выбрать наиболее оптимальные варианты – 6 наборов: олигонуклеотидный праймер – флуоресцентно-меченый зонд – олигонуклеотидный праймер. С использованием онлайн-приложения NCBI/Blast подтверждена высокая специфичности выбранных наборов олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов. Проведено моделирование совместимости внутреннего контроля и олигонуклеотидных праймеров и зондов для амплификации участков генов ИЛ-1?, COL2A1, MMP-8 в условиях мультиплексной ПЦР (две реакции в одной пробирке). В ходе проведенных исследований оптимизированы состав амплификационной смеси и условия термоциклирования дляамплификации участков генов ИЛ-1?, COL2A1, MMP-8 в условиях мультиплексной ПЦР.

С использованием метода секвенирования изучены нуклеотидные последовательности генетических детерминант, контролирующих синтез цитокинов (ИЛ-1?), коллагена (COL2A1), металлопротеиназ (MMP-8) в эпителиальных клетках полости рта пациентов. Для гена ИЛ-1? выявлена замена А521C в двух образцах, для гена COL2A1 в одном образце – замены C245A и C271A, для гена MMP-8 в одном образце – замена G137T.

Можно предположить, что выявленные в ходе исследований полиморфизмы встречаются в популяции и считаются вариантом биологической нормы, сами по себе они не являются непосредственной причиной развития заболевания, но способствуют усугублению тяжести его течения за счет особенностей протекания иммунных реакций конкретного макроорганизма в ответ на присутствие инфекционных агентов. То есть в человеческой популяции распространены генетические факторы, которые обусловливают биологический механизм, с помощью которого у некоторых индивидуумов под воздействием микробного фактора может проявляться более выраженный иммуновоспалительный ответ, что приводит к более тяжелому течению заболевания. Все это определяет необходимость проведения дальнейших научных исследований.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Леус П.А., Юдина Н.А. Заболевания периодонта. Диагностика. Профилактика. Лечение. Современные методы // Минск: Энергопресс. – 2015. – С. 386. / Leus P.A., Yudina N.A. Zabolevaniya periodonta. Diagnostika. Profilaktika. Lecheniye. Sovremennyye metody [Periodontal diseases. Diagnostics. Prevention. Treatment. Modern methods]. Minsk: Energopress, 2015, pp.386. (in Russian)

2. Юдина, Н.А. Эпидемиологическоеисследованиестоматологическихзаболеванийв миреиРеспубликеБеларусь / Н.А. Юдина, В.И. Долин, О.В. Юрис. – Германия, 2017. – 155 с. / Yudina N.A., Dolin V.I., Yuris O.V. Epidemiologicheskoye issledovaniye stomatologicheskikh zabolevaniy v mire i Respublike Belarus’ [Epidemiological study of dental diseases in the world and the Republic of Belarus]. Germaniya: Lambert. Academic Publishing, 2017, 155 p. (in Russian)

3. Руденкова, Т.В. Генетическиемаркерыпредрасположенностиквоспалительнымзаболеваниямпериодонта (парадонта) / Т.В. Руденкова, С.А. Костюк, Н.А. Юдина, М.О. Яковлева-Малых, О.С. Полуян, Т.В. Глинкина // Стоматологическийжурнал. – 2019. – №2. – С.85–90. / Rudenkova T.V., Kostyuk S.A., Yudina N.A., Yakovleva-Malykh M.O., Poluyan O.S., Glinkina T.V. Geneticheskiye markery predraspolozhennosti k vospalitel’nym zabolevaniyam periodonta (paradonta) [Genetic markers of predisposition to inflammatory diseases of the periodontal (periodontal)]. Stomatologicheskiy zhurnal, 2019, vol.2, pp.85–90. (in Russian)

4. Костюк, С.А. Предиктивнаямедицинаиметодыгенетическоготестирования / С.А. Костюк // Медицинскиеновости. – 2016. – №4. – С.11–14. Kostyuk S.A. Prediktivnaya meditsina i metody geneticheskogo testirovaniya [Predictive medicine and methods of genetic testin]. Meditsinskiye novosti, 2016, vol.4, pp.11–14. (in Russian)

5. Костюк, С.А. Валидациямолекулярно-биологическихметодовлабораторнойдиагностики / С.А. Костюк // Медицинскиеновости. – 2012. – №4. – С.16–19. / Kostyuk S.A. Validatsiya molekulyarno-biologicheskikh metodov laboratornoy diagnostiki [Validation of molecular biological methods of laboratory diagnostics]. Meditsinskiye novosti, 2012, vol.4, pp.16–19. (inRussian)

6. Бадыгина, Н.А. Организация системы контроля качества исследований методом полимеразной цепной реакции / Н.А. Бадыгина [и др.] // Лабораторная диагностика. ВосточнаяЕвропа. – 2012. – №1. – С.28–38. / Badygina N. A. [i dr.] Organizatsiya sistemy kontrolya kachestva issledovaniy metodom polimeraznoy tsepnoy reaktsii [Organization of the quality control system for research by the polymerase chain reaction method]. Laboratornaya diagnostika. Vostochnaya Yevropa, 2012, vol.1, pp.28–38. (in Russian)

7. Руденкова, Т.В. Анализнуклеотидныхзаменв генах, кодирующихбелкицитоадгезии Mycoplasma genitalium / Т.В. Руденкова // Репродуктивноездоровье. ВосточнаяЕвропа. – 2012. – №5. – С.185–188. / Rudenkova T.V. Analiz nukleotidnykh zamen v genakh, kodiruyushchikh belki tsitoadgezii Mycoplasma genitalium [Analysis of nucleotide substitutions in genes encoding Mycoplasma genitalium cytoadhesion proteins]. Reproduktivnoye zdorov’ye. Vostochnaya Yevropa, 2012, vol.5, pp.185–188. (in Russian)

8. Graves D., Cochran D. The contribution of interleukin-1 and tumor necrosis factor to periodontal tissue destruction. J Periodontol, 2003, vol.74, no.3, pp.391–401.

9. Hengartner N., et al. IL-1? inhibits human osteoblast migration. Mol Med, 2013, vol.19, pp.36–42.

10. Huang R., Yuan Y., Tu J., et al. Opposing TNF?-?/IL-1?- and BMP-2-activated MAPK signaling pathways converge on Runx2 to regulate BMP-2-induced osteoblastic differentiation. Cell Death Dis, 2014, vol.5.

11. Toyman U., Tüter G., Kurtis B., et al. Evaluation of gingival crevicular fluid levels of tissue plasminogen activator, plasminogen activator inhibitor 2, matrix metalloproteinase-3 and interleukin 1-? in patients with different periodontal diseases. J Periodontal Res, 2014, vol.2.

12. Hernández P., et al. Oral-fluid MMP analysis in the complementary diagnosis of periodontal diseases. Rev Clin Periodoncia Implantol Rehabil Oral, 2012, vol.5, no.3, pp.150–153.

13. Marcaccini A.M., Meschiari C.A., Zuardi L.R., et al. Gingival crevicular fluid levels of MMP-8, MMP-9, TIMP-2, and MPO decrease after periodontal therapy. J Clin Periodontol, 2010, vol.37, no.2, pp.180–190.

14. Leppilahti J.M., Hernández-Ríos P.A., Gamonal J.A., et al. Matrix metalloproteinases and myeloperoxidase in gingival crevicular fluid provide site-specific diagnostic value for chronic periodontitis. J Clin Periodontol, 2014, vol.41, no.4, pp.348–356.

15. Cavalla F., Osorio C., Paredes R., et al. Matrix metalloproteinases regulate extracellular levels of SDF-1/CXCL12, IL-6 and VEGF in hydrogen peroxide-stimulated human periodontal ligament fibroblasts. Cytokine, 2015, vol.73, no.1, pp.114–121.

Конфликт интересов

Согласно заявлению авторов, конфликт интересов отсутствует.

Современная стоматология. – 2020. – №3. – С.54-59.

Внимание! Статья адресована врачам-специалистам. Перепечатка данной статьи или её фрагментов в Интернете без гиперссылки на первоисточник рассматривается как нарушение авторских прав.