• Поиск:

издатель: ЮпокомИнфоМед

Джафарова Р.Э., Магеррамова Н.Ф.

Изучение изменения поведенческих реакций животных на фоне нового комплексного соединения на основе палладия и мексидола

Азербайджанский медицинский университет, Баку

Внимание! Статья адресована врачам-специалистам

Jafarova R., Maharramova N.F.

Azerbaijan Medical University, Baku

Study of the changes in behavioral responses of animals against the background of administration of a new palladium and mexidol based compound

Резюме. Изучена нейротоксичность нового комплексного соединения на основе палладия и мексидола (НКС) в сравнительном с цисплатином аспекте. Эксперимент ставили на 110 белых беспородных лабораторных крысах, разделенных на 3 группы: 1-я – контрольная, 2-я – основная, получавшая НКС, 3-я – сравнения, получала цисплатин в дозах, равной 1/10 LD50, в течение 7, 15 и 30 дней. По окончании введения веществ на протяжении 10 и 30 дней отслеживали состояние животных. Нейротоксичность определяли методом «открытое поле». На 7-й, 15-й и 30-й день исследования разница в количестве пройденных площадок составляет соответственно 79,01%, p<0,001, 127,45%, p<0,001, 100,00%, p<0,001; норковый рефлекс – 22,86%, p>0,05, 55,56%, p>0,05, 146,88%, p<0,001; вертикальная активность – 60,94%, p<0,005, 82,76%, p<0,005; 106,82%, p<0,001; количество груминга – 216,67%, 38,46%, p>0,05, 85,71%, p>0,05; в количестве болюсов 10,49%, p>0,05, 0,74%, p>0,05, 2,50%, p>0,05 соответственно. На 10-й и 30-й день наблюдений разница в количестве пройденных площадок составляет соответственно 133,33%, p<0,001, 275,00%, p<0,001; норковый рефлекс – 175,00%, p<0,001, 225,00%, p<0,001; вертикальная активность – 50,00%, p>0,05, 82,76%, p<0,005; количество груминга – 14,29%, p>0,05, 20,00%, p>0,05; в количестве болюсов 83,61%, p>0,05, 20,00%, p<0,001 соответственно. На фоне применения НКС патологические изменения поведенческих реакций животных менее выражены, чем на фоне применения цисплатина. После прекращения введения веществ нормализация исследуемых показателей в течение месяца наиболее активно на фоне НКС.

Ключевые слова: нейротоксичность, новое комплексное соединение на основе палладия и мексидола, цисплатин, «открытое поле».

Медицинские новости. – 2022. – №7. – С. 66–70.

Summary. The aim of the research was studying the neurotoxicity of new complex compound based on the palladium and mexidol (NCS) in comparative aspect with the cisplatin. The experiment was performed on 110 white sterile laboratory rats divided into 3 groups. The 1st group was the control group, the 2nd – main group, taking NCS, the 3rd – comparison group that took cisplatin, at the doses equal to 1/10 LD50 within 7, 15 and 30 days. After the injection of the substances had been completed, the status of the animals was monitored during 10 and 30 days. The neurotoxicity was determined using «open field» method. On the 7th, 15th and 30th day of the research, the difference in the number of passed platforms was 79.01%, p<0.001, 127.45%, p<0.001, 100.00%, p<0.001; hole-board test – 22.86%, p>0.05, 55.56%, p>0.05, 146.88%, p<0.001; vertical activity – 60.94%, p<0.005, 82.76%, p<0.005; 106.82%, p<0.001, grooming amount – 216.67%, 38.46%, p>0.05, 85.71%, p>0.05; and the difference in the bolus amount was 10.49%, p>0.05, 0.74%, p>0.05, 2.50%, p>0.05, correspondingly. On the 10th and 30th day of the observations the difference in the number of passed platforms was 133.33%, p<0.001, 275.00%, p<0.001; hole-board test – 175.00%, p<0.001, 225.00%, p<0.001; vertical activity – 50.00%, p>0.05, 82.76%, p<0.005; grooming amount – 14.29%, p>0.05, 20.00%, p>0.05; and the difference in the bolus amount was 83.61%, p>0.05, 20.00%, p<0.001, correspondingly. Against the background of the use of NCS, pathological changes in the behavioural reactions of the animals were less significant than against the background of the use of cisplatin. After the injection of the substances was ceased, the normalization of the indicators that had been researched during the month was most active against the background of NCS.

Keywords: neurotoxicity, new complex compound based on palladium and mexidol, cisplatin, open field.

Meditsinskie novosti. – 2022. – N7. – P. 66–70.

 

На данный момент во всем мире злокачественные новообразования по уровню заболеваемости и летальности занимают второе место после сердечно-сосудистой патологии [1]. Онкологические заболевания охватывают все возрастные категории населения. В лечении онкозаболеваний особое значение имеют химиотерапевтические средства. В широком арсенале химиотерапевтических средств хорошо себя зарекомендовали препараты платины [2, 3]. Однако высокая токсичность препаратов, особенно нефро-, гепато-, гемо-, нейротоксичность ограничивала их применение [4].

Известно, что по химическим свойствам палладий является двойником платины. Но положительным отличием соединений палладия является то, что они более лабильные и менее токсичные, чем соединения платины. Поэтому в последние годы поиск новых противобластомных средств проводится именно среди соединений палладия [5, 6].

На базе Научно-исследовательского центра Азербайджанского медицинского университета получено новое комплексное соединение палладия (II) с мексидолом. Изучение физико-химических свойств нового комплексного соединения палладия (II) с мексидолом (НКС) и первичные скрининговые исследования биологической активности показали перспективность данного соединения для применения в медицине в онкологической практике и как радиопротекторное средство. Исходя из этого, изучение токсичности данного соединения представляет практическую и научную значимость. Ряд наших исследований посвящены изучению острой, суб-острой и хронической гепато-, нефро-, гематоксичности данного соединения.

Цель исследования – изучить нейротоксичность НКС в сравнительном аспекте с цисплатином.

Материалы и методы

НКС (2-этил-6-метил-3-гидроксипиридин аммоний тетрахлор-палладиевокислый). ЛД50 для крыс-самцов =430 mg/kq, для белых мышей самцов – 355 mg/kq. Согласно классификации токсичности по Hodge и Sterner (1943), относится к группе умеренно токсичных веществ, а по классификации токсичности химических веществ в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76 квалифицируется как соединение 3-го класса опасности, которые разрешены к применению в медицине.

Эксперимент ставили на 110 белых беспородных лабораторных крысах.

1-я группа – контрольная, состоит из 10 крыс.

2-я группа – основная из 50 крыс, получавших исследуемое соединение в течение 7, 15 и 30 дней в дозе, равной 1/10 LD50, составляющей 0,004/100 г веса животного. Далее, на 10-е и 30-е сутки после прекращения приема исследуемого комплексного соединения определялись вышеприведенные показатели.

3-я группа – группа сравнения, состоящая из 50 крыс, получавших цисплатин в дозе, равной 1/10 LD50., что соответствует дозе 0,0007/100 г веса животного (1,3 мг для крысы весом 200 г, длиной туловища 20 см), также в течение 7, 15 и 30 дней, а затем на протяжении 10 и 30 дней отслеживали состояние животных.

Критерии включения животных в эксперимент: половозрелый возраст, вес в пределах 200220 г, шерстяной покров без повреждений, пол – самцы. Все животные, используемые в экспериментах, содержались в одинаковых условиях ухода и пищевого режима. Все эксперименты на животных проводились согласно «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях», Страсбург, 1986. Проведение эксперимента разрешено решением Этического комитета при Азербайджанском медицинском университете 10 от 16.10.2019.

Нейротоксичность НКС определяли методом «открытое поле», позволяющим оценить двигательную (количество пройденных площадок, вертикальная активность), исследовательскую (норковый рефлекс) активности, эмоциональный статус (груминг, количество болюсов).

В токсикологических экспериментах применяется модифицированный метод теста «открытое поле». Проводят определение ориентировочной реакции животных на открытой площадке по методу Boissier и соавт. (1964). Предпочтение для проведения данных отдается крысам, учитывая специфику их нервной системы. Крысы помещаются в центр горизонтальной площадки с белым гигиеническим покрытием размером 60?60 см и высотой 20 см, на которой имеются 16 площадок и 16 отверстий диаметром 4 см. В течение 3 минут выявляли изменения в физиологичном для грызунов «норковом рефлексе». Для этого отмечали количество заглядываний крысами в отверстия-норки. Изменения выявляли при сравнивании этого рефлекса у экспериментальных и интактных животных. Также определялась двигательная активность путем подсчитывания количества пройденных площадок, вертикальная активность – количество раз, когда животные поднимаются на задние лапки, количество груминга и болюсов.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с применением непараметрических методов: критерий Уилкоксона – Манна – Уитни (при сравнении независимых групп), метод знаков и ранговый метод Уилкоксона. Использованы программы MS Excel и S-Plus.

Результаты и обсуждение

Результаты выявления поведенческих изменений на фоне применения НКС представлены в таблице 1. Как видно из таблицы, начиная уже с 7-х суток после введения, все исследуемые показатели снижаются. Так, количество пройденных площадок понижается на 20,2%, норковый рефлекс – на 20,86%, вертикальная активность – на 15,57%, количество груминга – на 74,32%. Количество болюсов повышается на 109,84%. Эти данные показывают, что исследуемое соединение обладает нейротропностью, причем эффект – тормозящее действие на ЦНС, выражающееся в сниженной динамической активности (снижение количества пройденных площадок, норкового рефлекса, вертикальной активности) на фоне повышенной тревожности (сниженный груминг, повышенная дефекация).

На 15-й день исследований все исследуемые показатели продолжают изменяться однонаправленно с предыдущими данными. Так, количество пройденных площадок понижается на 42,86%, норковый рефлекс – на 31,29%, вертикальная активность – на 25,41%, количество груминга – на 83,78%. Количество болюсов повышается на 124,59%.

На 30-й день исследований количество пройденных площадок снижается на 65,52%, норковый рефлекс – на 51,53%, вертикальная активность – на 56,56%, количество груминга – на 94,14%. Количество болюсов повышается на 155,74%.

После прекращения применения НКС исследуемые показатели начинают улучшаться и стремятся к интактным значениям. На 10-й день после прекращения применения НКС количество пройденных площадок начинает увеличиваться, однако их меньше на 26,35%, чем у интактных животных. Норковый рефлекс также увеличивается, оставаясь сниженным по сравнению с интактными значениями на 38,65%. Вертикальная активность повышается, но на 45,90% меньше, чем у интактных животных. Повышается и количество груминга, теперь оно ниже, чем у интактных животных, на 76,58%. Количество болюсов было меньше, чем в 15-й день введения НКС, однако на 83,61% больше, чем у интактных животных.

На 30-й день после окончания введения НКС все исследуемые показатели стремились к интактным значениям, отличаясь от них: количество пройденных площадок – на 0,49%, норковый рефлекс – на 7,98%, вертикальная активность – на 12,30%, количество груминга – на 61,71%, количество болюсов повышается на 24,59%.

Таким образом, как видно из полученных результатов, после прекращения введения НКС поведенческие реакции животных восстанавливаются, что позволяет предположить, что кумуляции вещества в ЦНС не происходит.

Результатывыявления поведенческих изменений на фоне применения цисплатина (см. табл. 1) видно, что на 7-е сутки после введения животным цисплатина по сравнению с интактными значениями количество пройденных площадок понижается на 55,42%, норковый рефлекс – на 35,58%, вертикальная активность – на 47,54%, количество груминга – на 91,89%. Количество болюсов повышается на 134,43%.

 

Таблица 1. Изменение поведенческих реакций у животных на фоне применения НКС в тесте «Открытое поле»

Поведенческие реакции

Интактные

НКС

р

Цисплатин

р

7-й день

Количество площадок

13,53 (9,3–18,7)

10,80 (9,3–12,3)

p<0,05

6,03 (3,0–10,3)

p<0,001

Норковый рефлекс

5,43 (4,0–6,0)

4,30 (3,0–5,7)

p<0,01

3,50 (2,3–5,3)

p<0,001

Вертикальная активность

4,07 (2,3–6,3)

3,43 (2,3–5,3)

p>0,05

2,13 (0,7–4,3)

p<0,001

Груминг

7,40 (4,7–9,3)

1,90 (0,7–3,0)

p<0,001

0,60 (0,0–1,0)

p<0,001

Болюсы

2,03 (1,0–3,0)

4,27 (3,3–5,7)

p<0,001

4,77 (4,0–6,7)

p<0,001

15-й день

Количество площадок

13,53 (9,3–18,7)

7,73 (6,0–10,7)

p<0,001

3,40 (2,3–4,7)

p<0,001

Норковый рефлекс

5,43 (4,0–6,0)

3,73 (2,7–5,3)

p<0,001

2,40 (1,3–4,0)

p<0,001

Вертикальная. активность

4,07 (2,3–6,3)

3,03 (2,0–4,3)

p>0,05

1,47 (0,7–2,0)

p<0,001

Груминг

7,40 (4,7–9,3)

1,20 (0,3–2,0)

p<0,001

0,87 (0,0–2,0)

p<0,001

Болюсы

2,03 (1,0–3,0)

4,57 (4,0–5,7)

p<0,001

4,53 (3,3–5,3)

p<0,001

30-й день

Количество площадок

13,53 (9,3–18,7)

4,67 (3,7–5,7)

p<0,001

2,33 (0,3–4,0)

p<0,001

Норковый рефлекс

5,43 (4,0–6,0)

2,63 (1,0–4,3)

p<0,001

1,07 (0,3–2,0)

p<0,001

Вертикальная активность

4,07 (2,3–6,3)

1,77 (1,3–2,3)

p<0,001

0,97 (0,3–2,3)

p<0,001

Груминг

7,40 (4,7–9,3)

0,43 (0,0–1,0)

p<0,001

0,23 (0,0–1,0)

p<0,001

Болюсы

2,03 (1,0–3,0)

5,20 (4,3–6,3)

p<0,001

5,33 (4,3–6,0)

p<0,001

Через 10 дней после остановки введения

Количество площадок

13,53 (9,3–18,7)

9,97 (6,7–14,3)

p<0,01

3,93 (1,0–6,0)

p<0,001

Норковый рефлекс

5,43 (4,0–6,0)

3,33 (2,0–4,3)

p<0,001

1,53 (0,3–2,7)

p<0,001

Вертикальная активность

4,07 (2,3–6,3)

2,20 (0,3–3,3)

p<0,005

2,03 (0,7–3,3)

p<0,005

Груминг

7,40 (4,7–9,3)

1,73 (1,0–2,0)

p<0,001

1,90 (0,7–3,3)

p<0,001

Болюсы

2,03 (1,0–3,0)

3,73 (3,0–4,3)

p<0,001

3,90 (3,0–5,0)

p<0,001

Через 1 месяц после остановки введения

Количество площадок

13,53 (9,3–18,7)

13,47 (9,0–16,0)

p>0,05

6,40 (4,0–10,7)

p<0,001

Норковый рефлекс

5,43 (4,0–6,0)

5,00 (2,7–6,7)

p>0,05

2,77 (1,0–4,7)

p<0,001

Вертикальная активность

4,07 (2,3–6,3)

3,57 (2,3–5,0)

p>0,05

2,80 (1,3–4,0)

p<0,05

Груминг

7,40 (4,7–9,3)

2,83 (1,7–4,3)

p<0,001

2,47 (1,0–3,3)

p<0,001

Болюсы

2,03 (1,0–3,0)

2,53 (2,0–3,3)

p<0,05

3,63 (3,0–4,3)

p<0,001

 

На 15-й день исследований количество пройденных площадок понижается на 74,88%, норковый рефлекс – на 55,83%, вертикальная активность – на 63,93%, количество груминга – на 88,29%. Количество болюсов повышается на 122,95%.

На 30-й день исследований количество пройденных площадок снижается на 82,76%, норковый рефлекс – на 80,37%, вертикальная активность – на 76,23%, количество груминга – на 96,85%. Количество болюсов повышается на 162,30%.

На 10-й день после прекращения применения НКС количество пройденных площадок начинает увеличиваться, но при этом на 70,94% меньше, чем у интактных животных, норковый рефлекс также увеличивается, но остается сниженным по сравнению с интактными значениями на 71,78%. Вертикальная активность повышается, но на 50,00% меньше, чем у интактных животных, количество груминга также повышается, но ниже, чем у интактных животных на 74,32%. Количество болюсов уменьшается, но, несмотря на это, остается на 91,80% больше, чем у интактных животных.

На 30-й день после окончания введения НКС количество пройденных площадок начинает увеличиваться, но при этом на 52,71% меньше, чем у интактных животных, норковый рефлекс также увеличивается, но остается сниженным по сравнению с интактными значениями на 49,08%. Вертикальная активность повышается, но при этом на 31,15% меньше, чем у интактных животных, количество груминга повышается, но остается ниже, чем у интактных животных на 66,67%. Количество болюсов уменьшается, но несмотря на это больше на 78,69%, чем у интактных животных.

Сравнительная оценка результатов выявления поведенческих изменений на фоне применения НКС и цисплатина

Анализ результатов обеих групп (табл. 2) показал, что на 7-й день исследования патологические изменения поведенческих реакций в группе животных, получавших НКС, по сравнению с группой животных, получавших цисплатин, значительно ниже и в основном статистически достоверно. Так, разница в количестве пройденных площадок составляет 79,01%, p<0,001, норковый рефлекс – 22,86%, p>0,05, вертикальная активность – 60,94%, p<0,005, количество груминга – 216,67%, в количестве болюсов – 10,49%, p>0,05.

 

Таблица 2. Сравнительная оценка результатов выявления поведенческих изменений на фоне применения НКС и цисплатина

Поведенческие реакции

НКС

Цисплатин

р

Разница, %

7-й день

Количество площадок

10,80 (9,3–12,3)

6,03 (3,0–10,3)

p<0,001

79,01

Норковый рефлекс

4,30 (3,0–5,7)

3,50 (2,3–5,3)

p>0,05

22,86

Вертикальная активность

3,43 (2,3–5,3)

2,13 (0,7–4,3)

p<0,005

60,94

Груминг

1,90 (0,7–3,0)

0,60 (0,0–1,0)

p<0,005

216,67

Болюсы

4,27 (3,3–5,7)

4,77 (4,0–6,7)

p>0,05

10,49

15-й день

Количество площадок

7,73 (6,0–10,7)

3,40 (2,3–4,7)

p<0,001

127,45

Норковый рефлекс

3,73 (2,7–5,3)

2,40 (1,3–4,0)

p<0,005

55,56

Вертикальная активность

3,03 (2,0–4,3)

1,47 (0,7–2,0)

p<0,001

106,82

Груминг

1,20 (0,3–2,0)

0,87 (0,0–2,0)

p>0,05

38,46

Болюсы

4,57 (4,0–5,7)

4,53 (3,3–5,3)

p>0,05

0,74

30-й день

Количество площадок

4,67 (3,7–5,7)

2,33 (0,3–4,0)

p<0,001

100,00

Норковый рефлекс

2,63 (1,0–4,3)

1,07 (0,3–2,0)

p<0,001

146,88

Вертикальная активность

1,77 (1,3–2,3)

0,97 (0,3–2,3)

p<0,005

82,76

Груминг

0,43 (0,0–1,0)

0,23 (0,0–1,0)

p>0,05

85,71

Болюсы

5,20 (4,3–6,3)

5,33 (4,3–6,0)

p>0,05

2,50

Через 10 дней после остановки введения

Количество площадок

9,97 (6,7–14,3)

3,93 (1,0–6,0)

p<0,001

133,33

Норковый рефлекс

3,33 (2,0–4,3)

1,53 (0,3–2,7)

p<0,001

175,00

Вертикальная активность

2,20 (0,3–3,3)

2,03 (0,7–3,3)

p>0,05

50,00

Груминг

1,73 (1,0–2,0)

1,90 (0,7–3,3)

p>0,05

14,29

Болюсы

3,73 (3,0–4,3)

3,90 (3,0–5,0)

p>0,05

0,00

Через 1 месяц после остановки введения

Количество площадок

13,47 (9,0–16,0)

6,40 (4,0–10,7)

p<0,001

275,00

Норковый рефлекс

5,00 (2,7–6,7)

2,77 (1,0–4,7)

p<0,001

225,00

Вертикальная активность

3,57 (2,3–5,0)

2,80 (1,3–4,0)

p<0,05

0,00

Груминг

2,83 (1,7–4,3)

2,47 (1,0–3,3)

p>0,05

20,00

Болюсы

2,53 (2,0–3,3)

3,63 (3,0–4,3)

p<0,001

20,00

 

На 15-й день исследования разница в количестве пройденных площадок составляет 127,45%, p<0,001, норковый рефлекс – 55,56%, p>0,05, вертикальная активность – 106,82%, p<0,001, количество груминга – 38,46%, p>0,05, в количестве болюсов – 0,74%, p>0,05.

На 30-й день исследования разница в количестве пройденных площадок составляет 100,00%, p<0,001, норковый рефлекс – 146,88%, p<0,001, вертикальная активность – 82,76%, p<0,005, количество груминга – 85,71%, p>0,05, в количестве болюсов – 2,50%, p>0,05.

На 10-й день после прекращения применения НКС и цисплатина разница в количестве пройденных площадок составляет 133,33%, p<0,001, норковый рефлекс – 175,00%, p<0,001, вертикальная активность – 50,00%, p>0,05, количество груминга – 14,29%, p>0,05, в количестве болюсов – 0,00%, p>0,05.

На 30-й день после прекращения применения НКС и цисплатина разница в количестве пройденных площадок составляет 275,00%, p<0,001, норковый рефлекс – 225,00%, p<0,001, вертикальная активность – 0,00%, p<0,005, количество груминга – 20,00%, p>0,05, в количестве болюсов – 20,00%, p<0,001.

Из полученных данных видно, что на фоне применения НКС патологические изменения поведенческих реакций менее выражены, чем на фоне применения цисплатина. А после прекращения введения веществ нормализация исследуемых показателей в течение месяца наиболее активно происходит в группе, получавшей НКС. Это позволят сделать заключение, что НКС по сравнению с цисплатином оказывает на ЦНС меньшее токсическое действие.

График разницы показателей обеих групп (рисунок) позволяет отследить динамику процесса. Из диаграммы видно, что наименее выражена разница в изменении количества площадок и выраженности норкового рефлекса, которая прослеживается во все периоды наблюдений. Разница в количестве груминга особо ярко наблюдается на 3-й день исследования. Изменение вертикальной активности больше всего выражено на 3-й день применения веществ. Разница в количестве болюсов незначительна во все периоды наблюдений.

Учитывая, что в токсикологических тестах «открытое поле» снижение у животных количества пройденных площадок, норкового рефлекса и вертикальной активности свидетельствует о снижении динамической активности, а увеличение количества болюсов и снижение количества груминга – о повышенной тревожности [7]. Можно заключить, что оба соединения оказывают тормозящее действие ЦНС, более выраженное у цисплатина, особенно на центры двигательной и поисковой активности. Из диаграммы также видно, что изменения, вызванные цисплатином, более стойкие, чем на фоне применения НКС.

Таким образом, исследуемое новое комплексное соединение обладает нейротропностью, выражающееся тормозящим действием на двигательную и поисковую активность на фоне повышенной тревожности. Однако по сравнению с применением цисплатина эти изменения менее выражены и нивелируются в более короткий срок на фоне применения НКС.

 

Л И Т Е Р А Т У Р А

 

1. Жабагина А.С., Адылханов Т.А., Сандыбаев М.Н. и др. // Наука и здравоохранение. – 2019. – Т.21, №6. – С.24–29. doi: 10.34689/SH.2019.21.54535

2. Яценко Л.Д. // Вісник проблем біології і медицини. – 2014. – Т.106, №1. – С.36–40.

3. Bang Y.J., Kim Y.W., Yang H.K., et al. // Lancet. – 2012. – Vol.379 (9813). – P.315–321. doi: 10.1016/S0140-6736(11)61873-4

4. Serratrice M., Maiore L., Zucca A., et al. // Dalton Trans. – 2016. – Vol.45. – P.579–590. doi: 10.1039/C5DT02714D

5. Adam A.M. // Rus. J. Gen. Chem. – 2016. – Vol.86, N5. – P.1137–1143. doi: 10.1134/S1070363216050261

6. Churusova S.G., Aleksanyan D.V., Rybalkina E.Yu., et al. // Polyhedron. – 2018. – Vol.143. – P.70–82. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0277538717305508

7. Xi Su, Wenqiang Li, Zhen Li, et al. // Ecotoxicol. Environment. Safety. – 2021. – Vol.225. – P.112806.

 

Медицинские новости. – 2022. – №7. – С. 66-70.

Внимание! Статья адресована врачам-специалистам. Перепечатка данной статьи или её фрагментов в Интернете без гиперссылки на первоисточник рассматривается как нарушение авторских прав.

Содержание » Архив »

Разработка сайта: Softconveyer