Терапия инсулинзависимого сахарного диабета (ИЗСД) в настоя­щее время развивается по пути технического усовершенствования традиционных способов введения препаратов инсулина. Достижения на этом пути несомненны. Вместе с тем очевидно, что речь идет лишь о компенси­рующей терапии, поскольку в данном случае принципиально невозможно преодолеть целый ряд патологических процессов, сопряженных с развитием ИЗСД. Ведь сам способ введения инсулина в периферическую кровь проти­воречит природной системе глюкозного гомеостаза в организме. Постоян­ный высокий уровень гормона в общей циркуляции включает механизм за­щиты организма от избытка инсулина, что неизбежно ведет к возникнове­нию инсулинорезистентности [9] и общему осложнению заболевания [32]. В свою очередь несовершенство способов введения инсулина вызывает стрес­совые состояния организма и избыточный выброс в кровь контринсулярных гормонов, в ряде случаев усиливая патологическую направленность обмена.

Наиболее физиологичным путем введения инсулина в организм является пероральный способ, так как, всасываясь в кишечнике в кровь, гормон пол­ностью попадает в воротную систему печени. Однако разрушение гормона протеолитическими ферментами желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) дол­гое время мешало осуществить этот метод, в связи с чем предпринимались различные попытки защитить инсулин от воздействия протеаз желудка. Была изучена возможность перорального введения гормона, защищенного масля­ными эмульсиями [29, 49], полимерами [4, 27, 31, 42, 43], поверхностно-активными веществами вместе с ингибиторами протеаз [34], а также слож­ными комплексами бактериальной природы [39].

В последние годы внимание исследователей привлекает такая перспек­тивная пероральная лекарственная форма, как инсулин, инкапсулированный в липидные везикулы (липосомы) [7]. При оптимальном подборе липидного со­става эти частицы обладают высокой емкостью для соединений белковой природы, а составляющие их липиды, в отличие от синтетических полимер­ных капсул, являются эндогенным материалом, который включается в обыч­ные пути метаболизма.

Краткая характеристика липосом. 30 лет назад было установлено [24], что фосфолипиды в водной среде способны формировать замкнутые концентри­ческие бислойные мембраны (липосомы или везикулы), состоящие из бимо­лекулярного слоя липидов. При этом липосомы включают во внутренний объем воду и присутствующие в ней растворенные вещества. Вещества, рас­творимые в липидах, и амфифильные молекулы локализуются в липидном бислое. Таким образом, практически любое вещество независимо от его рас­творимости, размеров и электрического заряда может быть включенным в липосомы. Многие фосфолипиды сами по себе или в комбинации с другими липидами (включая липидные экстракты из мембран) могут формировать липосомы. Спустя некоторое время после открытия липосом они не только стали наиболее часто употребляющейся и адекватной моделью биологических мембран, но и начали изучаться в качестве биосо­вместимых "контейнеров" для доставки лекарственных веществ к органам-мишеням [12, 13, 20]. В последние годы проведено множество исследований по созданию липосомальных форм лекарственных соединений. Извест­ны липосомальные препараты для лечения опухолей, лейшманиоза, малярии, туберкулеза, артрозов, бруцел­леза и ряда других заболеваний [5, 20]. Липосомы, содер­жащие лекарственные вещества, могут использоваться для селективного воздействия на некоторые вирусные, пара­зитарные и грибковые заболевания, развивающиеся в клетках ретикулоэндотелиальной системы [18].

Возможность использования липосом для создания пероральной формы инсулина давно изучается в ряде лабораторий. Однако до сих пор окончательно не реше­ны как проблемы прохождения липосомами пищевари­тельного тракта без потери ими инсулина, так и вопросы их транспорта через мембраны эндотелиальных клеток в кровяное русло. Решение этих задач, вероятно, связано с правильным композиционным подбором липидов, состав­ляющих липосомы, а также с поиском дополнительных компонентов, оказывающих влияние на поведение ли­посом в организме.

Электронномикроскопические исследования показа­ли, что липосомальные препараты, обеспечивающие мак­симальное включение гормона, представляют собой бислойные липосомы размерами до 50 нм [21].

Недавно был описан препаративный способ приго­товления инсулинсодержащих липосом с помощью при­бора "Liposomate" [8]. Способ заключается в солюбилизации липидов и инсулина водными растворами детер­гентов с низкой критической концентрацией мицелло-образования, которые затем практически полностью от­деляются проточным диализом. Липосомы, полученные таким способом, обладают большой емкостью и включа­ют 51% исходного инсулина.

"Судьба" инсулинсодержащих липосом invivo. Вопре­ки ранее существовавшему представлению о липидах как о пассивном защитном материале их роль в судьбе липо­сом, введенных в организм, очень велика. Для того что­бы достичь рецептора на клеточной мембране, липосома с инсулином должна противостоять крайним значениям рН среды в ЖКТ, преодолеть стенку слизистой кишки или желудка и сохранить свою структуру в кровяном русле или в токе лимфы. На всех этапах сложного пути именно природа липидов определяет характер взаимо­действия липосом с окружающей средой.

Защищенность инсулина от разрушения ферментами определяется эффективностью встраивания инсулина, зависящей от метода приготовления липосом. Так, липо­сомы, полученные по методу обращенных фаз (упарива­нием органического растворителя из эмульсии липид — вода), в наибольшей степени предохраняют инсулин от разрушения [33]. Авторами работы также было замече­но, что разрушение инсулина трипсином усиливается при использовании нейтральных или отрицательно заряжен­ных липосом (содержащих 10% фосфатидилсерина, фосфатидилинозита или фосфатидной кислоты), причем уменьшение размеров последних от 2000 до 100 нм спо­собствовало разрушению инсулина протеолитическими ферментами. Инсулин, включенный в положительно за­ряженные липосомы, содержащие 10% стеариламина, был наименее доступен протеолитическим ферментам. Авто­ры не исключают того, что расщепление инсулина, встро­енного в отрицательно заряженные липосомы, объясня­ется не локализацией его на внешней поверхности, а бо­лее легким проникновением трипсина в такие липосомы [33]. Эффективная защита инсулина от протеолитического действия проназы наблюдается при введении в ли­посомы холестерина [43]. Доведение холестерина в сме­си липидов до соотношения 1:1 в 3 раза увеличивает ус­тойчивость липосом к действию желчи [19]. Разрушение липосом желчными кислотами приводит к образованию новых липидных структур, включающих эти кислоты и исходные компоненты [23]. Липосомы, температура фа­зового перехода которых выше температуры тела ("твер­дые липосомы"), труднее сливаются с клетками. Они со­рбируются на клеточной мембране и тем самым могут быть выведены из зоны действия протеаз. Адсорбция "твердых" липосом на клетке целиком определяется их зарядом [18]. Известно, что "твердые" липосомы эффек­тивно поглощаются клеткой путем клеточного эндоцитоза. Оба типа липосом связываются с трипсинчувствительными центрами на поверхности клеток, содержимое "жидких" при этом выходит наружу, а "твердые" оста­ются интактными. И "жидкие", и "твердые" липосомы взаимодействуют с одними и теми же или близко распо­ложенными участками клеточной поверхности, несмот­ря на различие в характере взаимодействия [3]. В работе [40] получены важные данные, указывающие на то, что "твердые" липосомы в физиологических условиях при 37°С проникают через кишечную стенку в интактном виде.

В кровяном русле липосомы дестабилизируются ком­понентами крови — альбумином, липопротеинами низ­кой плотности и т. д. [36, 48]. На стабильность липосом оказывает влияние возникающий иногда под воздейст­вием определенных условий на поверхности бислоя от­рицательный или положительный заряд, который резко уменьшает срок жизни липосом.

Иммунохимические и цитолитические свойства протеолипосом. Данные последних исследований говорят о том, что в процессе разработки липосомальных лекарствен­ных препаратов придется столкнуться с проблемой адьювантных свойств липосом. Другими словами, включение белков в липосомы приводит к возникновению выражен­ного иммунного ответа к антигенным детерминантам этих соединений [26, 30, 36, 47, 48]. Не исключено, что иммуногенность включенных в липосомы белков зависит от их локализации в липидном бислое. Так, в работе [30] на примере развития антительного ответа к иммуноглобу­линам было показано, что уровень образования антител зависит от локализации антигена. Уровень ответа к IgG, связанным с поверхностью липосом через стрептавидин-биотиновый мостик, был в десятки раз выше, чем ответ к IgG, встроенным в липосому обычным способом. Опи­раясь на эти данные, можно предположить, что чем глуб­же будет "запрятан" гаптен в липидный слой липосом, тем меньше возможность его взаимодействия с клеточ­ными рецепторами и ниже вероятность развития анти­тельного ответа. Подобные результаты получены и для включенного в липосомы альбумина [45, 47]. Однако име­ются совершенно противоположные данные. Например, было показано, что обработка трипсином липосом с по­верхностно-связанным альбумином приводит к незначи­тельной (30—50 %) потере иммуногенности [25] или не влияет на иммуногенность липосом [44].

При оральном введении многих антигенов возникает некоторый период иммуногенной толерантности к этому антигену [35, 51], что открывает перспективный путь ле­чения аутоиммунных расстройств. Продолжительное оральное введение инсулина мышам с аутоиммунной формой диабета не влияло на уровень глюкозы в крови, однако привело к редуцированию диабета, в том числе на клеточном уровне, что было определено тестами с Т-клетками [51].

Нами было проведено тестирование иммуногенности инсулина, включенного в липосомы из эквимолярной сме­си фосфатидилхолина и фосфатидилэтанола [11]. Выяс­нилось, что мыши линии BALB/c при четырехкратной иммунизации свиным инсулином, включенным в не­обработанные ультразвуком липосомы, не дают антитель­ного ответа. В то же время иммунизация мышей сво­бодным инсулином или инсулином, обработанным глутаровым альдегидом, в адьюванте Фрейнда приводит к появлению в сыворотках инсулинсвязывающих антител [11].

Помимо иммунохимических некоторые липосомы обладают цитолитическими свойствами. При инкубиро­вании стеариламинсодержащих липосом с эритроцитами кролика наблюдали гемолиз эритроцитов [50]. Разруше­ние эритроцитов зависит от концентрации стеариламина и химической структуры углеводородных цепей фосфолипидов, составляющих мембрану липосом. Липосомы, содержащие кислые фосфолипиды, ингибируют стеарил-амин-опосредованный гемолиз. Вполне вероятно, что взаимодействие липосом, содержащих стеариламин, с отрицательно заряженными компонентами на мембране эритроцитов является первой стадией сложного каскада процессов, приводящих к утечке гемоглобина. В то же время липосомы, содержащие нейтральные или кислые фосфолипиды, не вызывают лизиса эритроцитов и дру­гих клеточных структур.

Гипогликемический эффект инсулинсодержащих липо­сом. При пероральном введении липосомальной формы инсулина во многих случаях достигается значительное снижение уровня глюкозы. Однако, по данным различ­ных авторов, величина гипогликемического эффекта ва­рьирует в довольно широких пределах в зависимости от физико-химических свойств липосом [6, 15, 17, 28].

Авторы работы [37] исследовали липосомальный пре­парат инсулина, приготовленный из фосфатидилхолина, холестерина и отрицательно заряженного амфифильного вещества дицетилфосфата. Пероральное введение 12 ЕД липосомального инсулина крысам со стрептозотоциновым диабетом снижало уровень глюкозы до 42—62%, но не вызывало никакого эффекта у здоровых животных. Гипогликемический эффект сохранялся в течение 3 ч после введения препарата. До 75—80% от исходного сни­жался уровень глюкозы при введении крысам инсулин­содержащих липосом, сформированных из фосфатидилинозита [7].

А. Н. Россельс и др. [14] изучали терапевтическое дей­ствие инсулина, включенного в липосомы из смеси фос­фатидилхолина и холестерина в мольном соотношении 8:2. Введение этих липосом в желудок крысам с аллоксановым диабетом вызывало стойкую гипогликемию, про­лонгированную до 24 ч. При пероральном введении ин­сулина в составе липосом из такой же смеси в соотноше­нии 9:1 различным видам лабораторных животных (12 ЕД/кг) с четырьмя типами экспериментального диабета (аллоксановым, стрептозотоциновым, генетическим и хи­рургическим) наблюдали снижение уровня глюкозы до 73% от исходного. Эффект препарата существенно зави­сел от вида животного, его состояния и модели диабета [16]. Г. Даперголас и Г. Грегориадис [28] обнаружили бо­лее сильное гипогликемическое действие инсулинсодер­жащих липосом из синтетического дипальмитоил-фосфатидилхолина по сравнению с таковыми из природного фосфатидилхолина. Такие липосомы при температуре, со­ответствующей температуре тела человека и животных, находятся в гелеобразном ("твердом") состоянии. Высо­кую эффективность показали "твердые" инсулинсодержащие липосомы из эквимолярной смеси дипальмитоил-фосфатидилхолина и дипальмитоил-фосфатидилэтанола [1]. Введение крысам с аллоксановым диабетом та­ких липосом создавало устойчивую гиперинсулинемию в крови уже через 30 мин. Одновременно развивалась ги­погликемия со снижением глюкозы от 270 до 140 мг%. При введении "жидких" липосом на основе фосфатидил­холина и фосфатидилинозита гиперинсулинемия не толь­ко не коррелировала с гипогликемией, а наоборот, на фоне роста иммунореактивного инсулина в крови наблю­далось повышение концентрации сахара [2, 10]. Эти ре­зультаты свидетельствуют о важности физического состо­яния липосом в реализации гипогликемического эффек­та. Подтверждением такому заключению служат биоло­гические испытания "газодисперсного" препарата. Пе­роральное введение этого препарата уменьшает содержа­ние глюкозы в крови на 40% при вводимой дозе 12 ЕД инсулина на 1 кг веса животного, тогда как многослой­ные липосомы, приготовленные по методу Бэнгхема, вызывают снижение уровня глюкозы только на 7—12 % и при более высокой дозе — 50 ЕД/кг [22].

Необходимо отметить, что здоровые животные или вовсе не реагируют на липосомальный инсулин, или тре­буют в 5 раз больших доз вводимого гормона [16, 37]. Этот эффект объясняют снижением активности глутатионинсулинтрансгидрогеназы и функции желчеобразова­ния у животных с диабетом [16].

Следует подчеркнуть, что в последнее время выска­зываются и сомнения в ценности терапии сахарного диа­бета с помощью липосомального инсулина [46]. Они ос­новываются на необходимости применения высоких доз инкапсулированного гормона и вариабельности гликемического ответа на пероральной инсулин. Однако пред­ставленные литературные данные дают основание утверж­дать, что в результате научно обоснованного выбора хи­мического состава липосом возможно создание эффек­тивной лекарственной формы инсулина для перорального введения. Сложности с вариабельностью гликемического ответа можно преодолеть благодаря предваритель­ному индивидуальному тестированию больных. Приме­нения высоких доз не потребуется, если липосомы будут устойчивы к агрессивной среде ЖКТ и смогут в необхо­димых количествах проникать в кровяное русло. Такими свойствами обладают липосомы из полимеризованных липидов [38]. Полимерные липосомы чрезвычайно ус­тойчивы к физическим воздействиям, к действию орга­нических растворителей и детергентов, сохраняют свою целостность в различных технологических процессах, включая лиофилизацию. Отсутствие токсичности у поли­мерных липосом, выявленное при внутривенном введе­нии мышам, создает возможность использования этих микрокапсул для контролируемой доставки терапевтичес­ких агентов, особенно пероральным путем.

Литература

1. Ахрем А. А., Власов А. П., Воробьев М. С. и др. // Хим.–фарм. журн. – 1994. – № 10. – С. 34–37.

2. Ахрем А. А., Воробьев М. С., Кисель М. А. и др. // Пробл. эндокринологии. – 1995. – Т. 41, № 1. – С.37–39.

3. Байков Б. А., Галкина С. И., Нейфах А. А. и др. // Цитоло­гия. – 1985. – Т. 27, № 9. – С. 1021–1025.

4. Баранов В. Г., Щуковская Л. Л., Беловинцева М. Ф. и др. // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. – 1983. – Т. 95, № 3. – С. 86–87.

5. Владимирский М. А., Ладыгина Г А., Петюшенко Р. М. // Липосомы: применение в биологии и медицине. – М.: Наука, 1985. – С. 77–82.

6. Гавриленко Г. А., Ковалева Н. С., Вахрушева Л. А. и др. // Хим.–фарм. журн. – 1985. – Т. 19, № 12. – С. 144–149.

7. Гребенщиков Ю. Б., Мошковский Ю. Ш. // Итоги науки и техники. Биоорг. химия. – 1986. – Т. 7. – С. 255–291.

8. Грязнова Н. С., Петюшенко Р. М., Белявская И. В. и др. // Антибиотики и химиотерапия. – 1992. – Т. 37, № 7. – С. 3–8.

9. Древаль Г. И. // Сов. медицина. – 1985. – № 11. – С. 18–20.

10.   Забаровская З. В., Холодова Е. А., Воробьев М. С. и др. //Тез. докл. III Всесоюз. съезда эндокринологов. – Ташкент, 1989.– С. 202–203.

11.   Кулик Л. Н., Иванов В. С., Кисель М. А. // Биотехнология.–1995. – № 3–4. – С. 38–40.

12.   Ладыгина Г. А., Тенцова А. И., Зизина О. С. // Фармация.–1978. – Т. 27. – С. 52–57.

13.Липосомы в биологических системах / Под ред. Г.Грегориадиса, А.Аллисона. – М: Медицина, 1983. – 384 с.

14.Россельс А. П., Бухман А. А., Вахрушева Л. Л. и др. // Хим.–фарм. журн. – 1983. – № 1. – С. 52–55.

15.Стефанов А. В., Кононенко И. П., Лишко В. К., Шевченко А. В. и Укр. биохим. журн. – 1980. – Т. 52, № 4. – С. 497–500.

16.Стефанов А. В., Лишко В. К., Шевченко А. В. и др. // Укр. биохим. журн. – 1986. – Т. 58, № 2. – С. 58–64.

17.Тенцова А. И., Мошковский Ю. Ш., Зизина О. С. и др. // Хим.–фарм. журн. – 1983. – № 2. – С. 56–59.

18.Торчилин В. П. //Новости науки и техники (биотехноло­гия). – М.: Наука, 1988. – С. 3–22.

19.Ховака В. В. Изучение сахароснижающего действия ин­сулина, заключенного в липосомы, при пероральном введении экспериментальным животным: Автореф. дис. ... канд. хим. наук.–Киев, 1988.

20.   Швец В. И., Краснопольский Ю. М. // Вестн. АМН СССР.–1990. – № 6. – С. 19–28.

21.Штейнгарт М. В., Гончаров Н. И., Искрицкий Г. В. // Тез. докл. V съезда фармацевтов УССР. – 1984. – С. 93.

22.Штейнгарт М. В., Хаджай Я. И., Бугрим Н. А. и др. // Липосомы и их взаимодействие с клетками и тканями: Всесо­юз. симпоз. – М.: Наука, 1981. – С. 95–103.

23.Arien A., Henry–Toulme N., Dupuy В. // Biochim. Biophys. Acta. – 1994. – V. 1193, N 1. – P. 93–100.

24.Bangham A. D., Standish M. M., Watkins J. С. // J. Mol. Biol.–1965. – V. 3, N 1. – P. 238–252.

25.Beatty J. D., Beatty B. G, Paraskevas F., Froese E. // Sur­gery. – 1984. – V. 96. – P. 345.

26.Cohen S., Alonso M. J., hanger R. // Intern. J. Technol. Assess. Health Care. – 1994. – V. 10, N 1. – P. 121–130.

27.Damge C.,Michel C, Aprahamian M., Couvreur P. // Diabe­tes. – 1988. – V. 37, N 2. – P. 246–251.

28.Dapergolas G., Gregoriadis G. // Lancet. – 1976. – V. 2–P. 824–827.

29.Engel R. H., Riggi S. J., Farenbach M. J. // Nature. – 1968.–V. 219. – P. 856 – 857.

30.Phillips N., Emili A.//Immunol. Lett. – 1991. – N 30. – P. 291–296.

31.Gwinup G., Elias A. N., Domurat E. S. // Gen. Pharmacol. – 1991. – V. 22, N 2. – P. 243–246.

32.Gwinup G., Ellias A. N. // New Engl. J. Medicine. – 1990. –V. 322, N 5. – P. 333 – 334.

33.Kato Y., Hosokawa Т., Hayakawa E., Ito K. // Biol. Pharm. Bull. – 1993. – V. 16, N 5. – P. 457–461.

34.Kidron M., Krausz M. M., Raz I. et al. // Tenside Surfactants Detergents. – 1989. – V. 26, N 5. – P. 352–354.

35.Kozhich А. Т., Nussenblatt R. В., Gery I. / Eds. R.B. Nussenblatt, R.R. Whitcup, I. Gery // Adv. Ocur. Immunol. – 1994. – P. 217–220.

36.New R. R., Theakston R. D., Zumbuehl O. et al. // Toxic. – 1985. – V. 23, N 2. – P. 215–219.

37.Patel H. M., Ryman В. E. //FEBS Lett. – 1976. – V. 62, N 1. – P. 60–63.

38.Regen S. L. //Ann. N. Y. Acad. Sci. – 1985. – V. 446. – P. 296–307.

39.Roques M., Damge C., Michel С. et al. // Diabetes. – 1992. –V. 41, N 4. – P. 451–456.

40. Rowland R.N., Woodley J. F. // FEBS Lett. – 1981. – V. 123, N 1. – P. 41–44.

41. Saffian M. // J. Endocrinol. – 1991. – V. 131, N 2. – P. 267–278.

42. Saffian M., Kumar G. S., Savariar C. et al // Science. – 1986. – V. 233, N 4768. – P. 1081–1084.

43. Sarrach D., Lachmann U. // Pharmazie. – 1985. – Bd 40, N 9. – S. 642–645.

44. Shek P. N., Sabiston В. H. // Immunology. – 1982. – V. 47, N 4. – P. 627–632.

45. Snyder S. L., Vannier W. E. // Biochim. Biophys. Acta. – 1984. – V. 772, N 3. – P. 288–294.

46. Spangler R.S. // Diabetes Care. – 1990. – V. 13, N 9. – P. 911–922.

47. Van Rooijen N.,Van Nieuwmegen R. // Cell. Immunol. – 1980. – V. 49. – P. 402–407.

48. Wachsmann D., Klein J. P., Scholler M., Frank R. M. // Immunology. – 1985. – V. 54, N 1. – P. 189–193.

49. Weiner A. L., Carpenter–Green S. S., Soehngen E. C. et al. // J. Pharm. Science. – 1985. – V. 74, N 9. – P. 922–925.

50.Yoshihara E., Nakae T. // Biochim. Biophys. Acta. – 1986. – V. 854, N 1. – P. 93–101.

51.Zhang Z. J., Davidson L., Eisenbarth G., Weiner H. L. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1991. – V. 88, N 22. – P. 10252–10256.

Медицинские новости. – 1997. – № 3. – С. 17-21. 

Внимание! Статья адресована врачам-специалистам. Перепечатка данной статьи или её фрагментов в Интернете без гиперссылки на первоисточник рассматривается как нарушение авторских прав.